臨床全耐藥銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制的研究.pdf

1、銅綠假單胞菌(又稱綠膿桿菌)(Pseudomonasaeruginosa，P．A)為臨床常見的條件致病菌，在院內(nèi)感染中占重要地位，對多種抗生素天然耐藥是其特征。近年來，臨床上出現(xiàn)了多重耐藥銅綠假單胞菌(multi-drugresistantP.aeruginosa)甚至全耐藥銅綠假單胞菌(Pan-resistantP.aeruginosa對所有常規(guī)監(jiān)測抗菌藥物耐藥)¨J。對耐藥機(jī)制的研究有助于指導(dǎo)臨床用藥及開發(fā)新的有效藥物。 本

2、研究觀察了多藥外排泵抑制劑MC-207¨0(Phe-argβ—naphthyl-amidedihydrochloride)在體外逆轉(zhuǎn)全耐藥銅綠假單胞菌對多種抗生素的耐藥性；在分子水平對臨床分離的全耐藥銅綠假單胞菌株中多藥外排泵系統(tǒng)的基因表達(dá)情況進(jìn)行了定量分析；對全耐藥銅綠假單胞菌株中B一內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)率、型別進(jìn)行了分析。 第一部分：多藥外排泵抑制劑對全耐藥綠假單胞菌株耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用 首先以K-B紙片法觀察不同抑制劑濃度(

3、20，40，80[tg／mlMC-20711O)的效果，接著選擇20[tg／mlMC-207¨O，觀察其對臨床分離的全耐藥銅綠假單胞菌株耐藥性的MIC的改變程度，以初步明確多藥外排泵系統(tǒng)作用，同時(shí)了解多藥外排泵抑制劑MC-207110對其他抗生素MIC的改變情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用泵抑制劑能明顯降低環(huán)丙沙星(CIP)的MIC，下降倍數(shù)為4—8倍，變化率為100％；阿米卡星(AN)有15株MIC發(fā)生改變，變化率為40．5％，其中12株下降倍數(shù)達(dá)

4、8倍；哌拉西林(PIP)有31株MIC發(fā)生改變，變化率為84％；下降倍數(shù)為4—8倍，頭胞孢啶(CAZ)與頭孢噻肟(CTX)MIC的變化相近，均有17株，其中15株是相同的，變化率為43％，倍數(shù)為8—32倍。 第二部分：SYBRGreenI實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測全耐藥綠假單胞菌多藥外排泵的mRNA表達(dá) 建立以SYBRGreenI實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測多藥外排泵mRNA表達(dá)情況的方法，比較臨床分離的全耐藥與全

5、敏感銅綠假單胞菌中四種多藥外排泵MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM的mRNA表達(dá)水平的差異。結(jié)果顯示與全敏感銅綠假單胞菌相比，全耐藥銅綠假單胞菌四種多藥外排泵MexAB-OprM、MexCD一0prJ、MexEF—OprN、MexXY-0prM的mRNA的表達(dá)水平明顯增高(P<0．01)，還存在二種以上的泵同時(shí)高表達(dá)的情況。 第三部分：全耐藥綠假單胞菌株中β一內(nèi)酰胺酶的檢測

6、 首先Nitrocefin試驗(yàn)檢測上述菌株是否產(chǎn)生β內(nèi)酰胺酶；然后選擇陽性菌株進(jìn)行等電聚焦電泳以確定產(chǎn)多少種酶，并初步區(qū)分所產(chǎn)酶是那種類型；PCR及PCR產(chǎn)物測序進(jìn)一步確定β內(nèi)酰胺酶的種類；采用構(gòu)建重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21進(jìn)行克隆表達(dá)，再提取質(zhì)粒后測序以進(jìn)一步證實(shí)部分ESBLs；我們的實(shí)驗(yàn)表明在臨床全耐藥綠假單胞菌株中β一內(nèi)酰胺酶的含量并不低，36株中34株β一內(nèi)酰胺酶陽性；檢測出3種ESBLs：VEB-3、OXA．10和TE