泛耐藥銅綠假單胞菌體外耐藥模型構(gòu)建及其耐藥機(jī)制的研究.pdf

1、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是院內(nèi)獲得性感染的重要條件致病菌，可以引起嚴(yán)重的、甚至致死性的感染如肺炎、泌尿系統(tǒng)感染和血流感染等，而且可造成一定程度的院內(nèi)感染流行。由于廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用，銅綠假單胞菌對(duì)超廣譜抗生素的敏感性不斷在下降。多藥耐藥成了銅綠假單胞菌感染的一個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題，近年來(lái)更是出現(xiàn)了對(duì)除了多粘菌素外的所有抗假單胞的抗生素包括青霉素類、頭孢菌素、單酰胺類、氟喹諾酮類、氨基糖苷類和碳青酶烯類

2、等抗菌藥物同時(shí)耐藥的菌株，即泛耐藥銅綠假單胞菌（Pandrug-resistant Pseudomonas aeruginosa，PDRPA）。除多粘菌素外目前市面上有售的抗牛素對(duì)其完全無(wú)效，患者一旦感染，往往使臨床醫(yī)師束手無(wú)策，病死率極高，造成極其嚴(yán)重的臨床后果。顯然，PDRPA感染已經(jīng)成為臨床醫(yī)師所面臨的日益嚴(yán)重且迫切需要解決的課題。 對(duì)于泛耐藥銅綠假單胞菌的形成機(jī)制，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的研究。目前普遍認(rèn)為，銅綠假單胞菌外

3、膜低通透性和主動(dòng)外排系統(tǒng)與菌株對(duì)部分抗菌藥的固有耐藥有關(guān)，而銅綠假單胞的一個(gè)重要特性是獲得性耐藥，這與產(chǎn)生滅活酶、主動(dòng)外排系統(tǒng)高表達(dá)以及生物膜的形成有關(guān)。泛耐藥銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)制是復(fù)雜的，可能是多種耐藥機(jī)制的共同作用。但幾乎可以確定的是，泛耐藥銅綠假單胞菌耐藥的形成與抗菌素的應(yīng)用有明顯的關(guān)系。長(zhǎng)期的時(shí)間使銅綠假單胞菌暴露于多種抗生素之下是導(dǎo)致PDRPA出現(xiàn)的重要原因。 然而對(duì)于深層次的抗菌藥物如何使細(xì)菌形成這些耐藥機(jī)制，則報(bào)

4、道不多。目前知道抗菌藥物應(yīng)用與銅綠假單胞菌的耐藥關(guān)系緊密。但抗菌藥是如何作用使銅綠假單胞菌產(chǎn)生耐藥？目前有兩種觀點(diǎn)，即：（1）競(jìng)爭(zhēng)性抑制機(jī)制：抗生素應(yīng)用通過(guò)施加選擇性壓力使耐藥細(xì)菌增殖增加，體內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)性菌群生長(zhǎng)受到抑制。具體到某個(gè)患者的個(gè)體，選擇性壓力可以使細(xì)菌容易出現(xiàn)新的耐藥突變或出現(xiàn)耐藥菌既存的亞群。（2）適應(yīng)性突變：細(xì)菌長(zhǎng)時(shí)間暴露于抗菌藥物之可以產(chǎn)生自身突變而形成耐藥。國(guó)內(nèi)有報(bào)道稱以次抑菌濃度環(huán)丙沙星可誘導(dǎo)銅綠假單胞菌對(duì)其它喹諾酮類

5、和非同類抗菌素之間的交叉耐藥，次抑菌濃度亞胺培南亦可誘導(dǎo)PA耐藥的發(fā)生。在銅綠假單胞菌耐藥形成過(guò)程中，何者占主導(dǎo)地位，目前尚不明確。泛耐藥銅綠假單胞是否也可以通過(guò)單純抗菌藥物的誘導(dǎo)而形成呢？目前尚未見(jiàn)報(bào)道。如果能夠通過(guò)體外誘導(dǎo)的方法使敏感的銅綠假單胞菌株形成泛耐藥菌株，那么對(duì)揭示臨床分離的泛耐藥銅綠假單胞菌的形成機(jī)制研究無(wú)疑具有重要的意義，可以指導(dǎo)臨床銅綠假單胞菌感染的治療。 本研究擬通過(guò)體外多種藥物誘導(dǎo)，使敏感的銅綠假單胞菌株

6、轉(zhuǎn)變?yōu)榉耗退幍木辏⑦M(jìn)一步研究其耐藥機(jī)制，從而揭示抗生素應(yīng)用與泛耐藥銅綠假單胞菌生成的關(guān)系，為臨床銅綠假單胞菌感染的治療提供理論支持。并進(jìn)一步探討聯(lián)合抗菌藥物體外誘導(dǎo)對(duì)銅綠假單胞菌的耐藥性影響，以期對(duì)臨床治療有所幫助。 目的: 通過(guò)多種抗菌藥物體外誘導(dǎo)構(gòu)建泛耐藥銅綠假單胞菌體外模型，檢測(cè)其相關(guān)的耐藥機(jī)制；探討聯(lián)合抗菌藥物體外誘導(dǎo)對(duì)銅綠假單胞耐藥性的影響。 方法: 1.所有菌株均經(jīng)VITEK-2微生物分析

7、儀鑒定，并用K-B紙片擴(kuò)散法篩選出對(duì)臨床常用六類抗菌藥物包括抗假單胞菌性青霉素類、頭孢菌素、單酰胺類、碳青霉烯類、氟喹諾酮類和氨基糖甙類和多粘菌素B的敏感的銅綠假單胞菌。用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂平板二倍稀釋法測(cè)定其MIC值。 2.采用梯度濃度瓊脂平皿傳代誘導(dǎo)法，將4株細(xì)菌接種在含初始藥物濃度（1/4MIC）的M-H平板上連續(xù)傳代5代后轉(zhuǎn)入高一級(jí)濃度（1/2MIC），直至對(duì)該藥產(chǎn)生耐藥。然后進(jìn)入第二種藥物誘導(dǎo)，誘導(dǎo)藥物依次為頭孢他啶→哌拉西林/

8、他唑巴坦→氨曲南→環(huán)丙沙星→亞胺培南/西司他丁→丁胺卡那。誘導(dǎo)前后測(cè)定細(xì)菌的敏感性。 3.采用E-test法對(duì)誘導(dǎo)前的敏感株和誘導(dǎo)的泛耐藥菌株以及臨床分離的泛耐藥菌株進(jìn)行MBL檢測(cè)。 4.采用Real-time PCR技術(shù)對(duì)誘導(dǎo)前的4株敏感銅綠假單胞菌和誘導(dǎo)后的4株泛耐藥銅綠假單胞菌以及4株臨床分離的泛耐藥銅綠假單胞菌進(jìn)行主動(dòng)外排系統(tǒng)的檢測(cè)，包括：MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN和MexX

9、Y-OprM。 5.用亞胺培南、環(huán)丙沙星、阿米卡星和頭孢他啶單用或聯(lián)合用藥的方式，通過(guò)多步法誘導(dǎo)7株臨床分離的銅綠假單胞菌敏感株產(chǎn)生耐藥，連續(xù)培養(yǎng)5代。比較單藥和聯(lián)合用藥誘導(dǎo)后各代的MIC值。 結(jié)果: 1.經(jīng)誘導(dǎo)后4株敏感銅綠假單胞菌對(duì)六類抗菌藥物的敏感性下降，MIC明顯升高。按照CLSI耐藥折點(diǎn)4株菌株全部轉(zhuǎn)變?yōu)榉耗退幘辍?2.4株臨床分離的敏感銅綠假單胞菌株誘導(dǎo)前后MBL檢測(cè)均為陰性；臨床分離的4株

10、泛耐藥銅綠假單胞菌株MBL檢測(cè)有2株為陽(yáng)性，另外2株為陰性。 3.誘導(dǎo)前的4株敏感銅綠假單胞菌，4個(gè)外排系統(tǒng)均無(wú)高表達(dá)；相對(duì)于誘導(dǎo)前，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)成為泛耐藥菌株之后，4株耐藥誘導(dǎo)株均存在MexA-OprM外排系統(tǒng)高表達(dá)，有1株存在MexCD-OprJ和1株MexEF-OprN高表達(dá)，全部菌株均無(wú)MexXY-OprM高表達(dá)；在臨床分離的泛耐藥銅綠假單胞菌中，有1株所有4個(gè)主動(dòng)外排系統(tǒng)均高表達(dá)，有1株只有MexAB-OprM高表達(dá)，另外

11、三個(gè)外排系統(tǒng)無(wú)高表達(dá)，另外2株4個(gè)外排系統(tǒng)均無(wú)高表達(dá)。 4.單藥誘導(dǎo)48小時(shí)后，除含IPM和CIP濃度最高的平皿（4×MIC）中沒(méi)有菌落生長(zhǎng)，其余平皿均有菌落生長(zhǎng)。聯(lián)合用藥誘導(dǎo)后，沒(méi)有菌落生的平皿中含藥物的濃度下降。細(xì)菌對(duì)誘導(dǎo)藥物的MIC迅速升高，聯(lián)合用藥可以使銅綠假單胞菌對(duì)所誘導(dǎo)藥物的MIC升高幅度減少，且第一個(gè)48小時(shí)最為明顯。隨著用藥時(shí)間延長(zhǎng)，聯(lián)合用藥的優(yōu)勢(shì)逐漸下降。 結(jié)論: 1.在體外抗菌藥物的壓力下，敏