耐亞胺培南銅綠假單胞菌的分子耐藥機(jī)制研究.pdf

1、目的:銅綠假單胞菌（Pa）是一種臨床上常見的可引起嚴(yán)重院內(nèi)獲得性感染的條件致病菌，由于其固有與獲得性耐藥，使治療成為一大難題。亞胺培南（IPM）是臨床銅綠假單胞菌抗感染治療的常用碳青霉烯類抗生素，應(yīng)用廣泛，隨之引起的耐藥菌株也逐漸上升，而耐碳青霉烯類抗生素的Pa往往都是多重耐藥株，給臨床的抗感染治療帶來很大的困擾。本研究通過對從臨床標(biāo)本中分離的亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌（IRPa）的耐藥特征進(jìn)行分析、檢測相關(guān)耐藥基因以及整合子攜帶的耐藥基

2、因等，初步探討銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥的分子機(jī)制，從而了解不同的耐藥機(jī)制間相互作用的規(guī)律以及耐藥基因在菌株問水平傳播的特點(diǎn)，為指導(dǎo)臨床用藥提供幫助。 方法： 1、藥敏實(shí)驗(yàn)和三維實(shí)驗(yàn) 收集2003～2007年臨床分離的220株P(guān)a，對這些菌株采用K-B法測定10種臨床常用抗生素的藥敏情況，同時(shí)采用瓊脂稀釋法檢測亞胺培南的最低抑菌濃度（MIC），篩選出對亞胺培南耐藥的銅綠假單胞菌，并分析其對其它抗生素的藥物敏感率；

3、采用三維實(shí)驗(yàn)的方法分析220株P(guān)a產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶的類型。 2、碳青霉烯類水解酶和oprD2蛋白的檢測 針對鑒定的IRPa菌株，采用普通PCR方法檢測具有碳青霉烯水解作用的β內(nèi)酰胺酶耐藥摹因（GES、KPC、SPM、VIM、IMP、GIM基因）和oprD2基因，采用多重PCR的方法檢測OXA型基因和質(zhì)粒攜帶的AmpC酶基因，用熒光定量RT-PCR方法檢測oprD2蛋白基因表達(dá)情況；同時(shí)對產(chǎn)AmpC酶的Pa（25株，含IMP耐

4、藥和敏感株）用RT-PCR方法檢測AmpC酶基因的表達(dá)量情況。 3．整合子的鑒定與分析 利用整合酶基因PCR-RFLP方法篩選攜帶整合子的菌株，并對這些整合子進(jìn)行分類；整合酶陽性菌株用普通PCR擴(kuò)增檢測整合子的qacEΔ1-sull基因和整合子可變區(qū)的耐藥基因盒，并對整合子可變區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序及序列分析。探討整合子攜帶的耐藥基因盒是否介導(dǎo)銅綠假單胞菌對IPM的耐藥。 結(jié)果： 1．共篩選出IRPa菌株74

5、株，IRPa對美羅培南、三代頭孢類抗生素、氨曲南藥物的耐藥率都超過50％以上，特別是對頭孢噻肟的耐藥率達(dá)到81．08％，而對多黏菌素B、氨基糖苷類藥物和環(huán)丙沙星的敏感率相對較高，多粘菌素B的敏感率為100％，阿米卡星為70．27％，慶大霉素為62．16％，環(huán)丙沙星為51．35％。 2．本次試驗(yàn)共檢測到產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶菌株43株，β內(nèi)酰胺酶的檢出率為19．55％（43/220），其中產(chǎn)AmpC酶、超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBLs）、金屬酶

6、（MBL）、同時(shí)產(chǎn)生AmpC和ESBLs兩種酶（SSBLs）、未知酶型銅綠假單胞菌的構(gòu)成比分別是58．14％（25/43）、18．6％（8/43）、4．65％（2/43）、2．33％（1/43）和16．28％（7/43）。43株產(chǎn)酶菌株中對IPM耐藥的產(chǎn)酶株共有26株，這26株菌中除了產(chǎn)金屬酶（2株）與未知酶型菌株（7株）之外，其余均為產(chǎn)AmpC酶菌株，共17株，占總數(shù)的65．4％（17/26）。通過檢測AmpC酶對亞胺培南的水解實(shí)驗(yàn)可

7、以發(fā)現(xiàn)，有7株菌所產(chǎn)的AmpC酶可能對IPM有一定的水解作用。 3．PCR和多重PCR檢測銅綠假單胞菌IPM耐藥相關(guān)β內(nèi)酰胺酶基因，除I1197這株菌DHA摹因檢測結(jié)果為陽性，測序結(jié)果為DHA-1外，其余菌株IPM耐藥相關(guān)β內(nèi)酰胺酶基因PCR結(jié)果均為陰性；oprD2基因檢測為陰性的菌株有40株，占IRPa總數(shù)的54．05％（40/74）。 4．熒光定量RT-PCR對IRPa的oprD2摹因表達(dá)蛋白量的檢測，其結(jié)果與普通P

8、CR檢測結(jié)果相比較，大部分菌株的檢測結(jié)果兩者相一致；25株產(chǎn)AmpC酶陽性菌均有不同程度Ampc酶基因表達(dá)量升高，其中，1株攜帶DHA質(zhì)粒型AmpC酶基因，12株菌OprD2基因表達(dá)量減低，這些菌株均對亞胺培南耐藥，13株菌OprD2基因表達(dá)量正常，其中僅5株菌對亞胺培南耐藥；粗提酶能微弱水解IPM的7株菌，其AmpC酶基因的表達(dá)量均有明顯升高，其中5株菌同時(shí)伴有oprD2基因表達(dá)量降低。 5．74株IRPa中檢出16株（22．

9、86％）攜帶整合酶基因，這些基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶HinfⅠ酶切分析，均為Ⅰ類整合子，并且qacEΔ1-sull基因擴(kuò)增均為陽性。16株整合酶基因陽性的IRPa中，有14例檢出整合子可變區(qū)，共得到7種整合子耐藥基因盒的組合形式，這7種組合均攜帶有氨基糖苷類修飾酶基因，有些攜帶β內(nèi)酰胺酶基因及未知功能的基因。其中有4種為新發(fā)現(xiàn)的整合子可變區(qū)組合：①aac（6）-Ⅱ-catB3-ORFⅡ-ORFⅢ組合與②aac（6）-Ⅱ-unk

10、nown-CatB3組合有相同的耐藥基因aac（6）-Ⅱ和catB3，aac6-Ⅱ基因編碼對阿米卡星、奈替米星和妥布霉素的耐藥；catB3基因編碼氯乙酰基轉(zhuǎn)移酶，介導(dǎo)對氯霉素的耐藥；ORFⅡ基因編碼的蛋白質(zhì)可能是一種以RNA為模板的DNA聚合酶，也就是逆轉(zhuǎn)錄酶；unknown基因可能是一種新的轉(zhuǎn)座酶基因。③blaIMP-9-aacA4-OXA-10-aadA2-like組合，IMP-9是金屬酶基因，編碼對碳青霉烯類藥物的耐藥；aacA4

11、基因編碼氨基葡糖苷6-N-乙?；D(zhuǎn)移酶，產(chǎn)生對氨基糖苷類藥物的耐藥，OXA-10β內(nèi)酰胺酶基因編碼對頭孢噻肟、頭孢曲松和氨曲南的低水平耐藥；aadA2基因編碼對大觀霉素和鏈霉素的耐藥。④aac（6）-ⅡblaP1b-aadA2組合，其中blaP1b基因編碼對羧芐青霉素的耐藥。這些新發(fā)現(xiàn)的基因組合已在NCBI（美國國家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站）的Genebank上登錄，登陸序列號分別為FJ917747、FJ817422、FJ655384和FJ

12、958368、FJ817423。 結(jié)論： 1．耐亞胺培南的銅綠假單胞菌對多種抗生素呈多重耐藥和交叉耐藥。針對IRPa引起的感染，臨床醫(yī)生可根據(jù)病人具體情況，使用敏感性相對較高的抗生素進(jìn)行治療，如環(huán)丙沙星或氨基糖苷類藥物，對于泛耐藥的菌株可將多粘菌素B作為經(jīng)驗(yàn)用藥的選擇之一。 2．在產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶的菌株中，產(chǎn)AmpC酶的菌株檢出率是最高的，在產(chǎn)AmpC酶的銅綠假單胞菌中，存在一定數(shù)量（28％）能產(chǎn)生水解IMP的Amp

13、C酶菌株，AmpC酶水解IMP可能與Pa菌株的產(chǎn)酶量有關(guān)，說明AmpC酶的存在可能是銅綠假單胞菌對三代頭孢類抗生素以及IPM耐藥的一個重要因素。 3．oprD2蛋白的突變或表達(dá)量降低足IRPa對IPM耐藥的主要原因；無論P(yáng)a AmpC酶的表達(dá)量是高還是低，如果合并有oprD2基因表達(dá)量減少或缺失，均會導(dǎo)致其對亞胺培南耐藥；如果僅產(chǎn)生AmpC酶，但oprD2基因表達(dá)量正常，大部分菌株對亞胺培南敏感，小部分菌株可通過產(chǎn)酶或其它的機(jī)制

14、對IMP耐藥。總的來說，產(chǎn)AmpC酶銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥可能是AmpC酶表達(dá)量增加和oprD2表達(dá)量減低共同作用的結(jié)果，而oprD2蛋白缺失的作用可能更為突出。 4．整合酶陽性的IRPa中，僅檢出Ⅰ類整合子，未發(fā)現(xiàn)其它類型整合子。在這些Ⅰ類整合子中，共有7種整合子耐藥基因盒的組合形式，其中僅兩株IRPa的Ⅰ類整合子中攜帶的．IMP-9基因與IPM的耐藥有關(guān)，其它菌株的整合子中未檢測到相關(guān)的碳青霉烯類β內(nèi)酰胺酶的基因盒，其攜

15、帶的基因盒主要是介導(dǎo)Pa對氨基糖苷類與其它β內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，新發(fā)現(xiàn)4種整合子可變區(qū)耐藥基因盒組合：sac（6）-Ⅱ-unsown-CatB3、 aac（6）-Ⅱ-catB3-ORFⅡ-ORFⅢ、blaIMP-9-aad4-OXA-10和aadA2-like、asc（6’）-Ⅱ-blaP1b-aadA2，在NCBI的GENE BANK上登陸序列號分別為FJ917747、FJ817422、FJ655384和FJ958368、FJ8174