碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌耐藥機(jī)制和分子流行病學(xué)研究.pdf

1、目的：
　　明確上海市兒童醫(yī)院分離的碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant Klebsiella pneumonia,CRKP）對(duì)常用抗菌藥物的敏感性及其對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的主要耐藥機(jī)制；掌握上海市兒童醫(yī)院 CRKP主要的流行克隆群及耐藥菌的傳播機(jī)制，為預(yù)防和控制CRKP的大范圍播散提供參考。
　　方法：
　　1.收集上海市兒童醫(yī)院2013年1月-12月份12株CRKP、2014年3-6

2、月份22株CRKP及2014年6月-2015年6月70株CRKP三批細(xì)菌并收集病人一般臨床資料。
　　2.采用瓊脂稀釋法檢測(cè)CRKP對(duì)常用抗菌藥物的敏感性，乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA）協(xié)同實(shí)驗(yàn)和3’-氨基苯硼酸（3’-Aminobenzeneboronic acid，APB）協(xié)同實(shí)驗(yàn)對(duì)CRKP進(jìn)行表型篩選A組和B組碳青霉烯酶；PCR擴(kuò)增blaKPC、blaIMI、bl

3、aNDM、blaIMP、blaVIM、blaOXA等碳青霉烯酶耐藥基因、blaCTX-M等超廣譜β內(nèi)酰胺酶（Extended spectrumβ-lactamases，ESBLs）耐藥基因及 blaDHA、blaCIT等頭孢菌素酶（AmpC）耐藥基因，PCR產(chǎn)物送測(cè)序后所獲得的堿基序列在 NCBI BLAST上比對(duì)。
　　3.采用多位點(diǎn)序列分型（Multiple locus sequence typing,MLST）進(jìn)行基因分型，

4、PCR擴(kuò)增肺炎克雷伯菌7個(gè)管家基因（rpoB、gapA、mdh、Pgi、phoE、infB及tonB）后測(cè)序，所得序列在網(wǎng)站上比對(duì)后確定序列分型（sequence type，ST），采用脈沖場(chǎng)凝膠電泳（Pulsed field gel electrophoresis,PFGE）分析菌株之間的基因相關(guān)性，結(jié)果按照Tenover標(biāo)準(zhǔn)分析。
　　4.將基因陽(yáng)性的CRKP進(jìn)行接合實(shí)驗(yàn)（conjugation experiment）以確定耐

5、藥基因是否可通過可移動(dòng)元件在菌株間播散，耐藥菌經(jīng)S1核酸內(nèi)切酶酶切后進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳區(qū)分出耐藥菌的質(zhì)粒，用地高辛標(biāo)記的blaNDM-1探針與細(xì)菌質(zhì)粒進(jìn)行雜交，最終定位耐藥基因。
　　結(jié)果：
　　1.三批細(xì)菌多為多重耐藥菌，對(duì)包括青霉素、頭孢菌素類在內(nèi)的多種抗菌藥物耐藥率較高。對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥率也較高，其中對(duì)亞胺培南耐藥率分別為91.7%（11/12）、59.1%（13/22）和98.5%（69/70），三批細(xì)菌中均

6、未發(fā)現(xiàn)多黏菌素和替加環(huán)素耐藥菌。
　　2.EDTA協(xié)同實(shí)驗(yàn)和APB協(xié)同實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)碳青霉烯酶表型時(shí)具有較好的靈敏度和特異性；肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類藥物主要耐藥機(jī)制為產(chǎn)碳青霉烯酶，主要為產(chǎn)NDM-1和KPC-2型酶，PCR結(jié)果顯示三批菌中blaKPC-2和blaNDM-1的陽(yáng)性率分別為8.3%（1/12）、4.5%(1/22)、15.7%（11/70）和75%（8/12）、77.3%（17/22）、78.6%（55/70）。

7、>　　3.MLST結(jié)果顯示，第一批CRKP以ST11（58.3%，7/12）為主，另外還檢出 ST278（n=2）、ST37（n=1）、ST76（n=1）及 ST610（n=1）菌株；第二批 CRKP以 ST37（50%，11/22）和ST76(36.4%，8/22)為主，另外還檢出ST846（n=1）、ST11（n=1）及ST571（n=1）菌株；第三批CRKP主要為ST37（68.6%，48/70）為主，另外還檢出ST76(n=7)

8、、ST11（n=9）、ST258(n=2)、ST571(n=1)、ST610(n=1)及ST846(n=2)。PFGE結(jié)果顯示，第一批 CRKP分為4個(gè)型3個(gè)亞型（A1、A2、A3、B、C、D），其中ST11菌以PFGE-A1為主；第二批CRKP分為5個(gè)型（E、F、G、H、I），其中ST37和ST76菌分別以PFGE-E和PFGE-G為主，第三批CRKP分為7個(gè)型（E、G、I、J、K、L、M），ST37型菌以 PFGE-E型為主，PFG

9、E結(jié)果顯示，三階段醫(yī)院分離的細(xì)菌均存在某幾種脈沖型（PT）的克隆播散。
　　4.86.4%（19/22）CRKP與大腸埃希菌 J53或 EC600接合成功，藥敏結(jié)果顯示接合子對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥。15株blaNDM-1陽(yáng)性的CRKP經(jīng)S1核酸酶酶切后進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳發(fā)現(xiàn)細(xì)菌內(nèi)有1-4個(gè)質(zhì)粒，Southern blot雜交顯示blaNDM-1位于約為50-240kb的質(zhì)粒上，PBRT結(jié)果顯示46.7%（7/15）攜帶blaND

10、M-1的質(zhì)粒為Inc Frep。
　　結(jié)論：
　　1.2013-2015年，上海市兒童醫(yī)院兒童患者分離的肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥機(jī)制由產(chǎn)KPC-2酶轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)NDM-1酶，blaNDM-1陽(yáng)性的肺炎克雷伯菌已在醫(yī)院內(nèi)廣泛流行，加強(qiáng)耐藥菌監(jiān)測(cè)非常重要。
　　2.2013年分離的產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌主要以ST11為主，2014-2015年分離的產(chǎn)NDM-1的肺炎克雷伯菌主要以ST76和ST37為主，與國(guó)內(nèi)外