碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌耐藥機制和分子流行病學研究.pdf

1、目的：
　　明確上海市兒童醫(yī)院分離的碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant Klebsiella pneumonia,CRKP）對常用抗菌藥物的敏感性及其對碳青霉烯類抗菌藥物的主要耐藥機制；掌握上海市兒童醫(yī)院 CRKP主要的流行克隆群及耐藥菌的傳播機制，為預防和控制CRKP的大范圍播散提供參考。
　　方法：
　　1.收集上海市兒童醫(yī)院2013年1月-12月份12株CRKP、2014年3-6

2、月份22株CRKP及2014年6月-2015年6月70株CRKP三批細菌并收集病人一般臨床資料。
　　2.采用瓊脂稀釋法檢測CRKP對常用抗菌藥物的敏感性，乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA）協(xié)同實驗和3’-氨基苯硼酸（3’-Aminobenzeneboronic acid，APB）協(xié)同實驗對CRKP進行表型篩選A組和B組碳青霉烯酶；PCR擴增blaKPC、blaIMI、bl

3、aNDM、blaIMP、blaVIM、blaOXA等碳青霉烯酶耐藥基因、blaCTX-M等超廣譜β內酰胺酶（Extended spectrumβ-lactamases，ESBLs）耐藥基因及 blaDHA、blaCIT等頭孢菌素酶（AmpC）耐藥基因，PCR產(chǎn)物送測序后所獲得的堿基序列在 NCBI BLAST上比對。
　　3.采用多位點序列分型（Multiple locus sequence typing,MLST）進行基因分型，

4、PCR擴增肺炎克雷伯菌7個管家基因（rpoB、gapA、mdh、Pgi、phoE、infB及tonB）后測序，所得序列在網(wǎng)站上比對后確定序列分型（sequence type，ST），采用脈沖場凝膠電泳（Pulsed field gel electrophoresis,PFGE）分析菌株之間的基因相關性，結果按照Tenover標準分析。
　　4.將基因陽性的CRKP進行接合實驗（conjugation experiment）以確定耐

5、藥基因是否可通過可移動元件在菌株間播散，耐藥菌經(jīng)S1核酸內切酶酶切后進行脈沖場凝膠電泳區(qū)分出耐藥菌的質粒，用地高辛標記的blaNDM-1探針與細菌質粒進行雜交，最終定位耐藥基因。
　　結果：
　　1.三批細菌多為多重耐藥菌，對包括青霉素、頭孢菌素類在內的多種抗菌藥物耐藥率較高。對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥率也較高，其中對亞胺培南耐藥率分別為91.7%（11/12）、59.1%（13/22）和98.5%（69/70），三批細菌中均

6、未發(fā)現(xiàn)多黏菌素和替加環(huán)素耐藥菌。
　　2.EDTA協(xié)同實驗和APB協(xié)同實驗用于檢測碳青霉烯酶表型時具有較好的靈敏度和特異性；肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物主要耐藥機制為產(chǎn)碳青霉烯酶，主要為產(chǎn)NDM-1和KPC-2型酶，PCR結果顯示三批菌中blaKPC-2和blaNDM-1的陽性率分別為8.3%（1/12）、4.5%(1/22)、15.7%（11/70）和75%（8/12）、77.3%（17/22）、78.6%（55/70）。

7、>　　3.MLST結果顯示，第一批CRKP以ST11（58.3%，7/12）為主，另外還檢出 ST278（n=2）、ST37（n=1）、ST76（n=1）及 ST610（n=1）菌株；第二批 CRKP以 ST37（50%，11/22）和ST76(36.4%，8/22)為主，另外還檢出ST846（n=1）、ST11（n=1）及ST571（n=1）菌株；第三批CRKP主要為ST37（68.6%，48/70）為主，另外還檢出ST76(n=7)

8、、ST11（n=9）、ST258(n=2)、ST571(n=1)、ST610(n=1)及ST846(n=2)。PFGE結果顯示，第一批 CRKP分為4個型3個亞型（A1、A2、A3、B、C、D），其中ST11菌以PFGE-A1為主；第二批CRKP分為5個型（E、F、G、H、I），其中ST37和ST76菌分別以PFGE-E和PFGE-G為主，第三批CRKP分為7個型（E、G、I、J、K、L、M），ST37型菌以 PFGE-E型為主，PFG

9、E結果顯示，三階段醫(yī)院分離的細菌均存在某幾種脈沖型（PT）的克隆播散。
　　4.86.4%（19/22）CRKP與大腸埃希菌 J53或 EC600接合成功，藥敏結果顯示接合子對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥。15株blaNDM-1陽性的CRKP經(jīng)S1核酸酶酶切后進行脈沖場凝膠電泳發(fā)現(xiàn)細菌內有1-4個質粒，Southern blot雜交顯示blaNDM-1位于約為50-240kb的質粒上，PBRT結果顯示46.7%（7/15）攜帶blaND

10、M-1的質粒為Inc Frep。
　　結論：
　　1.2013-2015年，上海市兒童醫(yī)院兒童患者分離的肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥機制由產(chǎn)KPC-2酶轉變?yōu)楫a(chǎn)NDM-1酶，blaNDM-1陽性的肺炎克雷伯菌已在醫(yī)院內廣泛流行，加強耐藥菌監(jiān)測非常重要。
　　2.2013年分離的產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌主要以ST11為主，2014-2015年分離的產(chǎn)NDM-1的肺炎克雷伯菌主要以ST76和ST37為主，與國內外