產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌的耐藥性及其分子流行病學研究.pdf

1、[研究背景] 肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，K.pneumoniae)為革蘭陰性菌，屬于腸桿菌科克雷伯菌屬，其廣泛分布于自然界，是人類呼吸道和腸道的常居菌，常導致呼吸道、泌尿道、消化道和皮膚軟組織感染及敗血癥等，近年來已成為僅次于大腸桿菌的最重要的條件致病菌之一，在醫(yī)院獲得性感染中占有非常重要的地位。 隨著抗生素在臨床上的廣泛使用，肺炎克雷伯菌對抗生素的耐藥狀況日趨嚴重，由耐藥菌株導致的醫(yī)院感染

2、發(fā)生率逐年上升。β-內(nèi)酰胺類抗生素是治療肺炎克雷伯菌感染的有效藥物，然而隨著β-內(nèi)酰胺類抗生素尤其是第三代頭孢菌素在臨床上的大量應用，肺炎克雷伯菌對其耐藥性也逐年提高，給臨床抗感染治療帶來了極大挑戰(zhàn)。 產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrumβ-lactamase，ESBLs)是肺炎克雷伯桿菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要機制之一。ESBLs是細菌產(chǎn)生的能水解大多數(shù)青霉素、頭孢菌素和氨曲南等β-內(nèi)酰胺類抗生素且活

3、性能被酶抑制劑(如克拉維酸、舒巴坦、三唑巴坦)抑制的一類β-內(nèi)酰胺酶。ESBLs主要由質(zhì)粒介導，易在同種屬或不同種屬細菌之間水平傳播引起產(chǎn)酶菌醫(yī)院感染的暴發(fā)流行，而且產(chǎn)ESBLs細菌的質(zhì)粒常常攜帶氨基糖甙類、氯霉素或磺胺類抗生素耐藥基因，使產(chǎn)ESBLs菌株呈現(xiàn)多重耐藥性，進一步加大了臨床治療的難度。由于不同國家和地區(qū)的抗感染治療策略不同，臨床抗生素的使用管理亦有差別，常導致不同地區(qū)產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌流行的基因型和耐藥性也存在差異。

4、因此，了解本地區(qū)甚至本院產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌對常見抗生素的耐藥性及耐藥譜特征，在基因水平上檢測ESBLs的編碼基因，分析ESBLs在肺炎克雷伯菌中的流行基因型，可以有效指導臨床抗生素的合理使用，并對預防和控制肺炎克雷伯菌耐藥菌株的傳播和流行也具有非常重要的意義。 [目的] 1.了解中山大學附屬第三醫(yī)院臨床分離的肺炎克雷伯菌中ESBLs的流行情況及其對常見抗生素的耐藥譜特征，以指導臨床合理選用抗生素。 2.采用

5、PCR法對肺炎克雷伯菌攜帶的ESBLs耐藥基因進行初步分型，并對部分產(chǎn)ESBLs菌株進行DNA測序以確定其基因亞型，了解中山大學附屬第三醫(yī)院產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌的分子流行病學特征。 [材料與方法] 1、產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌流行狀況及耐藥性 1.1受試菌株：2007年1月至12月中山大學附屬第三醫(yī)院臨床分離的非重復肺炎克雷伯菌107株。 1.2ESBLs的表型篩選與確證試驗：采用CLSIMS100-

6、15文件(2005年版)推薦的ESBLs的表型篩選與確證試驗。 1.3藥物敏感性試驗：采用K-B(Kirby-Bauer)紙片法檢測107株臨床分離肺炎克雷伯菌對20種常見抗生素的敏感性，按CLSIMS100-15文件(2005年版)標準判斷結(jié)果。 1.4統(tǒng)計分析：采用辦公軟件MicrosoftExcel2003和統(tǒng)計學軟件SPSS13.0對肺炎克雷伯菌的藥敏試驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析，產(chǎn)ESBLs菌與非產(chǎn)ESBLs菌株敏感率

7、之間的比較應用X2檢驗，P<0.05有統(tǒng)計學意義。 2、產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌的分子流行病學研究 2.1受試菌株：ESBLs表型確證試驗陽性的肺炎克雷伯菌共46株。標準菌株：TEM-3、SHV-18、CTX-M-3、CTX-M-5、CTX-M-8等產(chǎn)ESBLs標準菌株。 2.2DNA模板的制備：采用煮沸裂解法制備DNA模板。 2.3引物設計：參照文獻設計5組常見的ESBLs基因引物：TEM型及SHV型通

8、用引物各一組；CTX-M型設計3組引物，分別為CTX-M-Ga包括CTX-M-8、9、13、14、16~19及Toho-2亞型：CTX-M-Gb包括CTX-M-2、4~7及Toho-1亞型；CTX-M-Gc包括CTX-M-1、3、10~12、15亞型。 2.4PCR擴增：ESBLs基因經(jīng)PCR擴增，產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳法，在含0.5μg/ml溴乙啶的1.5％瓊脂糖凝膠中電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并照相。 2.5DNA

9、測序分析：從PCR產(chǎn)物擴增陽性組中每組隨機挑選6株送測序公司切膠回收純化及測序，結(jié)果與GenBank提供的ESBLs基因核苷酸序列進行對比以確定其基因亞型。 [結(jié)果] 1.肺炎克雷伯菌中ESBLs產(chǎn)生率為43.0％(46/107)。 2.藥敏試驗結(jié)果顯示：①46株產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌對亞胺培南敏感率最高，為100％，其次為阿米卡星、哌拉西林/三唑巴坦，敏感率分別為82.6％、80.4％，產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯

10、菌對其余17種抗生素敏感率均<60‰②61株非產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌對氨芐西林、哌拉西林敏感率較低，為6.6％、55.7％；對甲氧芐啶/磺胺甲嗯唑敏感率為59.0％；其余17種抗生素對非產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌有較好的體外抗菌活性，敏感率為63.2％～96.7％。③產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌和非產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌對20種常見抗生素的敏感率比較結(jié)果顯示，除亞胺培南、阿米卡星、哌拉西林/三唑巴坦外，產(chǎn)ESBLs菌株對其他β-內(nèi)酰胺類抗

11、生素的敏感率均顯著低于非產(chǎn)ESBLs菌株(P<0.05)。 3.46株產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌PCR擴增結(jié)果顯示，43株(93.5％)產(chǎn)CTX-M型ESBLs其中CTX-M-Ga組陽性37株(80.4％)，CTX-M-Gb組未擴增出陽性條帶，CTX-M-Gc組陽性9株(19.6％)；11株(23.9％)產(chǎn)TEM型β-內(nèi)酰胺酶，13株(28.3％)產(chǎn)生SHV型β-內(nèi)酰胺酶。23株(50.0％)攜帶2種或2種以上β-內(nèi)酰胺酶基因型。

12、 4.隨機抽取樣本測序結(jié)果顯示，CTX-M型中有CTX-M-15、CTX-M-24、CTX-M-38ESBLs基因型，SHV型組中有SHV-11、SHV-12、SHV-28β-內(nèi)酰胺酶基因型，TEM型組檢出TEM-1型廣譜酶。 [結(jié)論] 1.中山大學附屬第三醫(yī)院產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌產(chǎn)生率高，ESBLs在本院肺炎克雷伯菌中已廣泛流行。產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌呈多重耐藥，對亞胺培南敏感率最高；產(chǎn)ESBLs菌株對抗