產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌的耐藥性及其分子流行病學(xué)研究.pdf

1、[研究背景] 肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，K.pneumoniae)為革蘭陰性菌，屬于腸桿菌科克雷伯菌屬，其廣泛分布于自然界，是人類(lèi)呼吸道和腸道的常居菌，常導(dǎo)致呼吸道、泌尿道、消化道和皮膚軟組織感染及敗血癥等，近年來(lái)已成為僅次于大腸桿菌的最重要的條件致病菌之一，在醫(yī)院獲得性感染中占有非常重要的地位。 隨著抗生素在臨床上的廣泛使用，肺炎克雷伯菌對(duì)抗生素的耐藥狀況日趨嚴(yán)重，由耐藥菌株導(dǎo)致的醫(yī)院感染

2、發(fā)生率逐年上升。β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素是治療肺炎克雷伯菌感染的有效藥物，然而隨著β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素尤其是第三代頭孢菌素在臨床上的大量應(yīng)用，肺炎克雷伯菌對(duì)其耐藥性也逐年提高，給臨床抗感染治療帶來(lái)了極大挑戰(zhàn)。 產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrumβ-lactamase，ESBLs)是肺炎克雷伯桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥的主要機(jī)制之一。ESBLs是細(xì)菌產(chǎn)生的能水解大多數(shù)青霉素、頭孢菌素和氨曲南等β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素且活

3、性能被酶抑制劑(如克拉維酸、舒巴坦、三唑巴坦)抑制的一類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶。ESBLs主要由質(zhì)粒介導(dǎo)，易在同種屬或不同種屬細(xì)菌之間水平傳播引起產(chǎn)酶菌醫(yī)院感染的暴發(fā)流行，而且產(chǎn)ESBLs細(xì)菌的質(zhì)粒常常攜帶氨基糖甙類(lèi)、氯霉素或磺胺類(lèi)抗生素耐藥基因，使產(chǎn)ESBLs菌株呈現(xiàn)多重耐藥性，進(jìn)一步加大了臨床治療的難度。由于不同國(guó)家和地區(qū)的抗感染治療策略不同，臨床抗生素的使用管理亦有差別，常導(dǎo)致不同地區(qū)產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌流行的基因型和耐藥性也存在差異。

4、因此，了解本地區(qū)甚至本院產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌對(duì)常見(jiàn)抗生素的耐藥性及耐藥譜特征，在基因水平上檢測(cè)ESBLs的編碼基因，分析ESBLs在肺炎克雷伯菌中的流行基因型，可以有效指導(dǎo)臨床抗生素的合理使用，并對(duì)預(yù)防和控制肺炎克雷伯菌耐藥菌株的傳播和流行也具有非常重要的意義。 [目的] 1.了解中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院臨床分離的肺炎克雷伯菌中ESBLs的流行情況及其對(duì)常見(jiàn)抗生素的耐藥譜特征，以指導(dǎo)臨床合理選用抗生素。 2.采用

5、PCR法對(duì)肺炎克雷伯菌攜帶的ESBLs耐藥基因進(jìn)行初步分型，并對(duì)部分產(chǎn)ESBLs菌株進(jìn)行DNA測(cè)序以確定其基因亞型，了解中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌的分子流行病學(xué)特征。 [材料與方法] 1、產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌流行狀況及耐藥性 1.1受試菌株：2007年1月至12月中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院臨床分離的非重復(fù)肺炎克雷伯菌107株。 1.2ESBLs的表型篩選與確證試驗(yàn)：采用CLSIMS100-

6、15文件(2005年版)推薦的ESBLs的表型篩選與確證試驗(yàn)。 1.3藥物敏感性試驗(yàn)：采用K-B(Kirby-Bauer)紙片法檢測(cè)107株臨床分離肺炎克雷伯菌對(duì)20種常見(jiàn)抗生素的敏感性，按CLSIMS100-15文件(2005年版)標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。 1.4統(tǒng)計(jì)分析：采用辦公軟件MicrosoftExcel2003和統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0對(duì)肺炎克雷伯菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，產(chǎn)ESBLs菌與非產(chǎn)ESBLs菌株敏感率

7、之間的比較應(yīng)用X2檢驗(yàn)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2、產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌的分子流行病學(xué)研究 2.1受試菌株：ESBLs表型確證試驗(yàn)陽(yáng)性的肺炎克雷伯菌共46株。標(biāo)準(zhǔn)菌株：TEM-3、SHV-18、CTX-M-3、CTX-M-5、CTX-M-8等產(chǎn)ESBLs標(biāo)準(zhǔn)菌株。 2.2DNA模板的制備：采用煮沸裂解法制備DNA模板。 2.3引物設(shè)計(jì)：參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)5組常見(jiàn)的ESBLs基因引物：TEM型及SHV型通

8、用引物各一組；CTX-M型設(shè)計(jì)3組引物，分別為CTX-M-Ga包括CTX-M-8、9、13、14、16~19及Toho-2亞型：CTX-M-Gb包括CTX-M-2、4~7及Toho-1亞型；CTX-M-Gc包括CTX-M-1、3、10~12、15亞型。 2.4PCR擴(kuò)增：ESBLs基因經(jīng)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳法，在含0.5μg/ml溴乙啶的1.5％瓊脂糖凝膠中電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并照相。 2.5DNA

9、測(cè)序分析：從PCR產(chǎn)物擴(kuò)增陽(yáng)性組中每組隨機(jī)挑選6株送測(cè)序公司切膠回收純化及測(cè)序，結(jié)果與GenBank提供的ESBLs基因核苷酸序列進(jìn)行對(duì)比以確定其基因亞型。 [結(jié)果] 1.肺炎克雷伯菌中ESBLs產(chǎn)生率為43.0％(46/107)。 2.藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示：①46株產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南敏感率最高，為100％，其次為阿米卡星、哌拉西林/三唑巴坦，敏感率分別為82.6％、80.4％，產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯

10、菌對(duì)其余17種抗生素敏感率均<60‰②61株非產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌對(duì)氨芐西林、哌拉西林敏感率較低，為6.6％、55.7％；對(duì)甲氧芐啶/磺胺甲嗯唑敏感率為59.0％；其余17種抗生素對(duì)非產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌有較好的體外抗菌活性，敏感率為63.2％～96.7％。③產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌和非產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌對(duì)20種常見(jiàn)抗生素的敏感率比較結(jié)果顯示，除亞胺培南、阿米卡星、哌拉西林/三唑巴坦外，產(chǎn)ESBLs菌株對(duì)其他β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗

11、生素的敏感率均顯著低于非產(chǎn)ESBLs菌株(P<0.05)。 3.46株產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，43株(93.5％)產(chǎn)CTX-M型ESBLs其中CTX-M-Ga組陽(yáng)性37株(80.4％)，CTX-M-Gb組未擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶，CTX-M-Gc組陽(yáng)性9株(19.6％)；11株(23.9％)產(chǎn)TEM型β-內(nèi)酰胺酶，13株(28.3％)產(chǎn)生SHV型β-內(nèi)酰胺酶。23株(50.0％)攜帶2種或2種以上β-內(nèi)酰胺酶基因型。

12、 4.隨機(jī)抽取樣本測(cè)序結(jié)果顯示，CTX-M型中有CTX-M-15、CTX-M-24、CTX-M-38ESBLs基因型，SHV型組中有SHV-11、SHV-12、SHV-28β-內(nèi)酰胺酶基因型，TEM型組檢出TEM-1型廣譜酶。 [結(jié)論] 1.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌產(chǎn)生率高，ESBLs在本院肺炎克雷伯菌中已廣泛流行。產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌呈多重耐藥，對(duì)亞胺培南敏感率最高；產(chǎn)ESBLs菌株對(duì)抗