廣東地區(qū)三種醫(yī)院感染革蘭氏陰性菌分子流行病學及耐藥性研究.pdf

1、背景：肺炎克雷伯菌是人類呼吸道和腸道的常見菌,也是重要的條件致病菌,可引起呼吸道、泌尿道、腸道、血液、手術切口、皮膚軟組織等多個部位感染。嗜麥芽窄食單胞菌也是條件致病菌,不僅廣泛分布于自然界,人類的皮膚、口咽部、上呼吸道和腸道也均有該菌寄居,在醫(yī)院環(huán)境和醫(yī)務人員中的分離率也很高；近年來嗜麥芽窄食單胞菌所致感染不斷上升,已成為醫(yī)院內感染的重要致病菌。銅綠假單胞菌是一種常見的條件致病菌,廣泛分布于自然界、正常人皮膚、腸道、呼吸道及醫(yī)院病房、

2、醫(yī)療器械等,是目前醫(yī)院內感染的主要致病菌之一；在機體抵抗力下降時(例如感染、手術、腫瘤化療、燒傷及氣管切開等各種侵襲性醫(yī)學操作)能引起人體局部或全身性感染。以上三種革蘭氏陰性菌在醫(yī)院感染中占有越來越重要的地位,因此,深入了解這三種細菌引起的醫(yī)院感染分子流行病學特點及其耐藥特點,對預防和控制醫(yī)院感染有重要意義。
　　 內容和目的：
　　 (1)了解廣東地區(qū)醫(yī)院感染肺炎克雷伯菌、嗜麥芽窄食單胞菌以及銅綠假單胞菌的分布特點,并

3、采用脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrothotesis PFGE)將臨床分離到的上述三種革蘭氏陰性菌進行基因分型,分析醫(yī)院感染菌株的同源性。
　　 (2)了解廣東地區(qū)肺炎克雷伯菌、嗜麥芽窄食單胞菌、銅綠假單胞菌感染的耐藥特征,并探討不同醫(yī)院來源菌株耐藥率的差異以及菌株耐藥譜與基因型之間的關系。
　　 (3)通過PCR對多重耐藥菌株進行擴增及整合子分類,了解肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄

4、食單胞菌中Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ類整合子(IntⅠ、IntⅡ、IntⅢ)的攜帶現狀。
　　 (4)對整合子陽性菌株進一步檢測整合子的可變區(qū),分析插入基因盒的序列,了解菌株所攜帶的耐藥基因盒的種類、特點及與菌株耐藥的關系。
　　 (5)了解廣東地區(qū)肺炎克雷伯菌、嗜麥芽窄食單胞菌、銅綠假單胞菌攜帶耐消毒劑基因qacE△1的情況,及qacE△1陽性菌株對醫(yī)院常用消毒劑抗力與qacE△1陰性菌株、標準菌株之間的差異。
　　 方法：<

5、br>　　 (1)收集廣東地區(qū)5家三級甲等綜合和?？漆t(yī)院臨床分離的醫(yī)院感染肺炎克雷伯菌、嗜麥芽窄食單胞菌和銅綠假單胞菌。所有菌株經生化鑒定,疑難菌株進一步經VITEK232型全自動細菌鑒定儀鑒定確認。同時對收集的醫(yī)院感染病例資料進行描述性分析。
　　 (2)采用脈沖場凝膠電泳對廣東地區(qū)5家醫(yī)院臨床分離的肺炎克雷伯菌、嗜麥芽窄食單胞菌、銅綠假單胞菌進行基因分型,明確是否為同一菌株的克隆。
　　 (3)采用藥敏試驗(K—B

6、紙片擴散法)檢測上述三種醫(yī)院感染革蘭氏陰性菌對16種常用抗菌藥物的耐藥率情況,并選取耐藥譜相同的菌株進行PFGE基因分型比較分析。
　　 (4)根據文獻報道以及NCBI序列,選擇目標基因保守片段進行高特異PCR檢測,了解上述菌株攜帶IntⅠ、IntⅡ、IntⅢ情況。
　　 (5)對整合子陽性菌株進一步以保守序列引物擴增,對可變區(qū)擴增產物測序分析,所得結果在GenBank數據庫中進行同源性比對,了解可變區(qū)中含有的基因盒及其

7、攜帶耐藥基因。
　　 (6)根據耐消毒劑基因qacE△1序列設計引物,應用PCR方法檢測肺炎克雷伯菌、嗜麥芽窄食單胞菌、銅綠假單胞菌攜帶耐消毒劑基因qacE△1的情況。
　　 (7)采用定量殺菌試驗,研究qacE△1陽性菌株對醫(yī)院常用消毒劑抗力與qacE△1陰性菌株、標準菌株之間的差異。
　　 (8)統(tǒng)計方法在Epidata3.0建立數據庫,數據進行雙錄入,用SPSS13.0軟件進行數據分析。樣本率的比較用x2檢

8、驗。
　　 結果：
　　 (1)2009年1月～2010年6月,在廣東省5家三級甲等綜合和專科醫(yī)院收集的醫(yī)院感染病例標本中共分離出160株肺炎克雷伯菌、134株嗜麥芽窄食單胞菌和243株銅綠假單胞菌。其中廣州市胸科醫(yī)院分離的肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌最多,分別占總數的32.5％(52/160)和30.9％(75/243)；深圳市兒童醫(yī)院分離的嗜麥芽窄食單胞菌最多,占總數的35.8％(48/134)。汕頭市中心醫(yī)院和汕頭大

9、學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院分離的三種醫(yī)院感染革蘭氏陰性菌處于中等水平,廣東藥學院附屬第一醫(yī)院分離的菌株數量最少。各年齡組上述三種革蘭氏陰性菌分布趨勢圖呈“U”型,菌株主要來源于<1歲組、66-75歲和75歲以上感染較多,提示老年人和嬰幼兒是醫(yī)院感染的重點預防對象。菌株來源按科室由高至低進行排序,前6位分別ICU、新生兒病房、神經內科、腫瘤科、血液科。因此,ICU、新生兒病房、呼吸內科是醫(yī)院感染監(jiān)控的重點科室。肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞和嗜麥芽窄

10、食單胞菌主要分離于呼吸道、泌尿道、敗血癥和手術相關部位。
　　 (2)160株肺炎克雷伯菌、134株嗜麥芽窄食單胞菌和243株銅綠假單胞菌經酶切的染色體DNA在脈沖場中電泳成像后,顯示13～20條大小不等的DNA片斷,PFGE基因圖譜經Bionumerics V4.0軟件聚類分析,相似值在25.1％～100％之間,廣州市胸科醫(yī)院的3號與11號,19號與20號,22號與23號,25號與26號及54號與64號,深圳市兒童醫(yī)院的2號與

11、5號及4號與8號肺炎克雷伯菌；廣東藥學院附屬第一醫(yī)院的2號與5號,深圳兒童醫(yī)院1號與50號、7號與8號以及28號、33號和39號,汕頭市中心醫(yī)院的50號與61號嗜麥芽窄食單胞菌；廣東藥學院附屬第一醫(yī)院的3號與8號,廣州胸科市醫(yī)院的38號與39號,47號與57號及27號與62號,深圳市兒童醫(yī)院的8號與19號及64號與65號,23號、24號、37號以及2號、3號、9號,汕頭市中心醫(yī)院的3號與4號,17號與18號及10號與13號銅綠假單胞菌完

12、全同源,多發(fā)生在同一醫(yī)院的同一病房或病區(qū)；其余菌株則顯示了較低的同源性或者無同源性。
　　 (3)肺炎克雷伯菌耐藥率超過50％的常用抗生素依次為氨芐西林、哌拉西林、頭孢氨芐、頭孢唑啉、氨曲南、復方新諾明、頭孢他啶和慶大霉素；嗜麥芽窄食單胞菌對大部分常用抗生素耐藥,除復方新諾明、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和哌拉西林/他唑巴坦外,耐藥率均超過50％；銅綠假單胞菌耐藥率大于50％的常用抗菌藥物依次為復方新諾明、頭孢唑啉、氨芐西林、

13、頭孢噻肟、頭孢氨芐和哌拉西林。
　　 (4)在廣州市胸科醫(yī)院的PFGE聚類分析圖譜中,觀察5對完全同源的肺炎克雷伯菌株的耐藥譜,發(fā)現除3號與11號的耐藥譜表現完全一致外,其他4對均有不同程度且沒有規(guī)律的區(qū)別,說明同一種基因型可表現為不同的耐藥表型。同時,發(fā)現37號與51號肺炎克雷伯菌,耐藥譜完全相同,然而經聚類分析,其相似值僅為68.8％。選取耐藥譜相同的7株嗜麥芽窄食單胞菌和22株銅綠假單胞菌經PFGE聚類分析圖譜,發(fā)現也存在

14、上述類似情況。
　　 (5)30株肺炎克雷伯菌中檢出11株(36.67％)(11/30)攜帶IntⅠ、17株(56.67％)(17/30)攜帶IntⅡ,未檢出攜帶Ⅲ類整合子基因:30株嗜麥芽窄食單胞菌中檢出7株(23.33％)(7/30)攜帶IntⅠ,未檢出攜帶Ⅱ、Ⅲ類整合子基因；30株銅綠假單胞菌中檢出23株(76.67％)(23/30)攜帶IntⅠ,7株攜帶(23.33％)(7/30)IntⅡ,1株(3.33％)(1/30)

15、攜帶IntⅢ基因。
　　 (6)IntⅠ和IntⅡ均為陽性的肺炎克雷伯菌有3株,為廣東藥學院附屬第一醫(yī)院的2037號和2997號菌株,以及廣州市胸科醫(yī)院的21號菌株。IntⅠ和IntⅡ均為陽性的銅綠假單胞菌有7株,分別為廣東藥學院附屬第一醫(yī)院的2669號菌株,廣州市胸科醫(yī)院的15號和24號以及深圳兒童醫(yī)院的3、9、26、27號菌株。IntⅠ和IntⅢ均為陽性的銅綠假單胞菌有1株,為廣東藥學院附屬第一醫(yī)院的3159號菌株。

16、　　 (7)IntⅠ陽性肺炎克雷伯菌的可變區(qū)長度為502bp、IntⅠ陽性嗜麥芽窄食單胞菌的可變區(qū)長度為3610bp、IntⅠ陽性銅綠假單胞菌的可變區(qū)長度為1679bp;IntⅡ陽性肺炎克雷伯菌的可變區(qū)長度為776bp、IntⅡ陽性銅綠假單胞菌的可變區(qū)長度為1070bp；IntⅢ陽性銅綠假單胞菌的可變區(qū)長度為1250bp。
　　 (8)經對可變區(qū)擴增產物的測序及序列分析共得到6種整合子耐藥基因盒的組合形式,IntⅠ陽性肺炎克雷

17、伯菌可變區(qū)經測序得到cmlA耐藥基因盒的組合形式,cmlA耐藥基因盒表達對氯霉素類抗生素耐藥。IntⅡ陽性肺炎克雷伯菌可變區(qū)經測序得到aadA4耐藥基因盒的組合形式,其中aadA(對氨基甙類抗生素耐藥)基因盒是最常見的基因盒,對照該菌株的耐藥譜,與其對慶大霉素、阿米卡星耐藥的特性相吻合。IntⅠ陽性的嗜麥芽窄食單胞菌可變區(qū)經測序得到aac-7+Oxa-7+blap+aadB+ORF-E耐藥基因盒的組合方式,該株嗜麥芽窄食單胞菌耐藥性分析

18、顯示,其除對哌拉西林/他唑巴坦敏感外,對氨基糖甙類、β內酰胺類、喹諾酮類、碳青霉烯類、磺胺類等15種抗生素耐藥性嚴重。隨機選取1株IntⅠ陽性、1株IntⅡ和IntⅢ陽性的銅綠假單胞菌進行整合子可變區(qū)陽性擴增產物的測序及序列分析,結果顯示,Ⅰ類整合子經測序得到aac-3+aad2的組合形式；Ⅱ類整合子經測序得到CmlA耐藥基因盒；Ⅲ類整合子得到bla-MAP耐藥基因盒。其中aad-3和aad2為氨基糖甙類抗生素耐藥基因盒；CmlA為氯霉

19、素耐藥基因盒；bla-MAP為金屬β-內酰胺酶耐藥基因盒,均與三株銅綠假單胞菌的耐藥特性相對應。
　　 (9)在30株肺炎克雷伯菌中檢出11例耐消毒劑基因qacE△1陽性(36.67％)(11/30)；在30株嗜麥芽窄食單胞菌中檢出4株陽性(13.33％)(4/30)；在30株銅綠假單胞菌中檢出26株陽性(86.67％)(26/30)。
　　 (10)有效碘濃度為200mg/L和150mg/L時,作用時間7min,仍分別

20、有7.7％和15.4％耐消毒劑基因qacE△1陽性銅綠假單胞菌及6.7％和10.0％耐消毒劑基因qacE△1陰性銅綠假單胞菌的臨床分離株存活。苯扎氯銨濃度為300mg/L和250mg/L時,作用時間7min,仍分別有11.5％和15.4％耐消毒劑基因qacE△1陽性及6.7％和20.0%耐消毒劑基因qacE△1陰性銅綠假單胞菌的臨床分離株存活。有效氯濃度為500mg/L和375mg/L時,作用時間10min,仍分別有19.2％和38.5

21、％耐消毒劑基因qacE△1陽性及10.0%和36.7％耐消毒劑基因qacE△1陰性銅綠假單胞菌的臨床分離株存活。
　　 結論：
　　 (1)廣東地區(qū)160株肺炎克雷伯菌、134株嗜麥芽窄食單胞菌和243株銅綠假單胞菌引起的醫(yī)院感染中,以<1歲組、66-75歲和75歲以上多見；科室分布,前6位分別為ICU、新生兒病房、神經內科、腫瘤科、血液科；標本來源以痰標本為主,主要分離于呼吸道、泌尿道、敗血癥和手術相關部位。
　

22、　 (2)分子流行病學分析顯示,廣東地區(qū)5家醫(yī)院收集的肺炎克雷伯菌、嗜麥芽窄食單胞菌和銅綠假單胞菌為多克隆構成,表現為基因多態(tài)性,說明監(jiān)測期間的醫(yī)院感染病例主要為散發(fā)。
　　 (3)160株肺炎克雷伯菌、134株嗜麥芽窄食單胞菌和243株銅綠假單胞菌均多為多重耐藥菌株,PFGE圖譜和耐藥譜比較可以看出,同一克隆型的菌株對抗生素的耐藥譜不盡相同,而不同克隆型的菌株也可擁有完全相同的抗生素耐藥譜,提示菌株的基因型與抗生素耐藥譜之間

23、并無必然聯系。
　　 (4)本研究發(fā)現銅綠假單胞菌Ⅰ類整合子的檢出率最高,肺炎克雷伯菌Ⅱ類整合子的檢出率最高,嗜麥芽窄食單胞菌未檢出攜帶Ⅱ、Ⅲ類整合子基因。其中30株銅綠假單胞菌中檢出1株(3.33％)攜帶IntⅢ基因,為國內首次報道。
　　 (5)經對可變區(qū)擴增產物的測序及序列分析共得到6種整合子耐藥基因盒的組合形式,其中aad-3和aad2為氨基糖甙類抗生素耐藥基因盒,CmlA為氯霉素耐藥基因盒；bla-MAP為金屬