健康人群攜帶艱難梭菌的分子流行病學(xué)及其耐藥性研究.pdf

1、目的:艱難梭菌（Clostridium difficile, CD）是梭菌屬中的一種專性厭氧菌，可形成卵圓形芽孢，位于菌體次極端。該菌主要通過(guò)糞口途徑進(jìn)行傳播，并且可導(dǎo)致艱難梭菌相關(guān)性腹瀉（Clostridium difficile associateddiarrhea，CDAD）。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道健康成人艱難梭菌的攜帶率大約是1％-7％，而兒童的攜帶率可高達(dá)75％，但往往都沒(méi)有表現(xiàn)出腹瀉等相應(yīng)的臨床癥狀。艱難梭菌芽孢對(duì)消毒劑如乙醇、肥皂、高

2、溫和干燥有很強(qiáng)的抵抗力，可以在物體表面存活數(shù)月到數(shù)年，利于其傳播。一般認(rèn)為艱難梭菌感染與抗生素使用及住院史有關(guān)，但最近研究表明艱難梭菌感染的流行狀況和發(fā)病率正發(fā)生改變，尤其是在沒(méi)有使用過(guò)抗生素及無(wú)CDAD危險(xiǎn)因素的人群中艱難梭菌感染的比例不斷上升。國(guó)外對(duì)健康人群艱難梭菌的攜帶情況已有相關(guān)數(shù)據(jù)，但國(guó)內(nèi)尚缺乏相關(guān)研究并且存在地理位置、種族和生活習(xí)慣等差異。因此本研究為了解河北地區(qū)健康人群艱難梭菌的流行病學(xué)特征，擬對(duì)健康人群攜帶菌株的相關(guān)特征

3、做一系列研究如PCR核糖體分型、多位點(diǎn)序列分型(Multilocus sequence typing，MLST)和耐藥情況，以期為艱難梭菌感染（Clostridium difficile infection，CDI）的防控提供依據(jù)。
　　方法:
　　1、從2013年9月至2014年9月期間，收集邢臺(tái)某縣健康嬰兒(＜1歲)糞便標(biāo)本36份;邢臺(tái)一所幼兒園和滄州兩所幼兒園健康兒童(1-8歲)糞便標(biāo)本共1661份;社區(qū)健康體檢成人（

4、＞18歲）糞便標(biāo)本1654份和醫(yī)務(wù)工作者糞便標(biāo)本348份，以上人群均不存在腹瀉等相應(yīng)臨床癥狀。
　　2、對(duì)糞便標(biāo)本采用富集芽孢法進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，根據(jù)艱難梭菌的扁平狀菌落、鏡下革蘭染色細(xì)菌形態(tài)及芽孢位置、馬廄性氣味以及生化反應(yīng)進(jìn)行鑒定。
　　3、采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，對(duì)提取的DNA采用多重PCR檢測(cè)毒素（tcdA、tcdB、cdtA、cdtB）和16SrDNA以此符合艱難梭菌的鑒定。
　　4、對(duì)所有菌株

5、進(jìn)行核糖體分型，分型結(jié)果使用Quantity One軟件進(jìn)行比較;對(duì)產(chǎn)毒株進(jìn)行MLST分型，采用START2系統(tǒng)對(duì)ST序列進(jìn)行聚類分析;用eBURST v3軟件將ST型進(jìn)行親緣關(guān)系分析。將健康人群分離到的菌株與CDI患者的菌株進(jìn)行型別比對(duì)，分析同源性。
　　5、采用瓊脂稀釋法測(cè)定艱難梭菌對(duì)萬(wàn)古霉素、甲硝唑、非達(dá)霉素、利福昔明、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、美羅培南和氯霉素的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concent

6、ration, MIC)。
　　結(jié)果:
　　1、從36份嬰兒糞便標(biāo)本中共分離培養(yǎng)出艱難梭菌9株，總攜帶率為25％(9/36)，7株艱難梭菌均為tcdA+tcdB+cdtA-cdtB-，產(chǎn)毒株攜帶率為19.4％(7/36);1661份幼兒園健康兒童糞便標(biāo)本中共分離培養(yǎng)出艱難梭菌222株，總攜帶率為13.4％(222/1661)，其中146株為tcdA+tcdB+cdtA-cdtB-，產(chǎn)毒株攜帶率為8.7％(146/1661);

7、邢臺(tái)A幼兒園、滄州B幼兒園及滄州C幼兒園兒童攜帶率分別為13.6％(127/931)、13.1％(79/600)、12.3％(16/130)。1654份健康成人糞便標(biāo)本中共分離培養(yǎng)出艱難梭菌91株，總攜帶率為5.5％，其中59株為tcdA+tcdB+cdtA-cdtB-，1株為tcdA+tcdB+cdtA+cdtB+，產(chǎn)毒株攜帶率為3.6％(60/1654)。348份醫(yī)務(wù)工作者糞便標(biāo)本中共分離培養(yǎng)出艱難梭菌22株，總攜帶率為6.3％(2

8、2/348)，其中13株為毒素tcdA+tcdB+cdtA-cdtB-，產(chǎn)毒株攜帶率為3.7％(13/348)。
　　2、PCR核糖體分型共分為24個(gè)不同的型別，和河北地區(qū)成人住院腹瀉患者艱難梭菌分離株相比，腹瀉患者的12個(gè)型別除1個(gè)型別（1株），其余11個(gè)型別在健康人群中均有發(fā)現(xiàn)。226株產(chǎn)毒艱難梭菌被分為27個(gè)不同的ST型，其中ST54型（等位基因譜1-4-7-1-1-3-3）66株，ST3型（等位基因譜1-1-2-1-1-1

9、-1）58株，ST35型（等位基因譜2-5-8-1-1-3-6）24株，ST2型（等位基因譜1-1-2-1-5-3-1）22株，此4個(gè)型別占到菌株數(shù)的75.2％(170/226)。此外本研究還發(fā)現(xiàn)3個(gè)新的ST型，分別為ST286（等位基因譜1-1-2-3-1-5-3）1株，ST289（等位基因譜1-1-7-1-5-3-1）1株和ST290（等位基因譜13-17-22-33-26-38-40）1株。ST型別與宿主人群來(lái)源之間不存在明顯的相

10、關(guān)性，STs-2，3，35，37，53，54，和55的菌株既有來(lái)自健康人群的菌株也有來(lái)自腹瀉患者的菌株。
　　3、所有菌株對(duì)萬(wàn)古霉素、甲硝唑、非達(dá)霉素和利福昔明均高度敏感。但是對(duì)左氧氟沙星和環(huán)丙沙星的耐藥率較高，分別為39.8％和98.3％。對(duì)美洛培南和氯霉素的耐藥率較低，分別為1.45％和2％。
　　結(jié)論:
　　1、河北地區(qū)健康嬰兒和幼兒園健康兒童艱難梭菌的攜帶率與國(guó)外報(bào)道相比偏低，但產(chǎn)毒株攜帶率較高;其中嬰兒艱難梭

11、菌定植率和添加輔食有相關(guān)性。社區(qū)健康成人、醫(yī)務(wù)工作者艱難梭菌的攜帶率與國(guó)外報(bào)道相似。
　　2、目前本研究發(fā)現(xiàn)在河北地區(qū)健康人群中艱難梭菌以ST54和ST3為優(yōu)勢(shì)型別，其中健康兒童以ST3和ST54為主，健康成人以ST54為主。
　　3、健康人群攜帶的艱難梭菌與引起CDI的菌株具有同源性，提示無(wú)癥狀定植人群可能作為艱難梭菌及其芽孢的儲(chǔ)存庫(kù)，成為社區(qū)獲得性CDI潛在的傳染源。
　　4、目前河北地區(qū)健康人群攜帶的艱難梭菌對(duì)萬(wàn)