2010-2015年臨床分離艱難梭菌產(chǎn)毒株的分子流行病學(xué)、耐藥狀況以及對利福霉素耐藥機制研究.pdf

1、目的：21世紀(jì)以來，加拿大、美國和歐洲等世界多國相繼暴發(fā)醫(yī)院獲得性腹瀉，死亡率及復(fù)發(fā)率高，罪魁禍?zhǔn)妆闶瞧D難梭菌。有報道稱，15-25％的抗生素相關(guān)性腹瀉和超過95%的偽膜性腸炎與艱難梭菌有關(guān)。毒素A（TcdA）和毒素B（TcdB）為該菌的兩個主要致病因子。臨床上廣泛應(yīng)用的頭孢菌素和氟喹諾酮等抗生素可破壞腸道菌群平衡，使得產(chǎn)毒艱難梭菌過度繁殖，與艱難梭菌感染（CDI）最為相關(guān)，其他危險因素包括高齡、化療藥物的使用、炎癥性腸病、器官移植、慢

2、性腎臟疾病、免疫低下和其他嚴(yán)重的合并疾病等。該菌形成的芽孢可抵抗多種理化因素，包括醫(yī)院常用的酒精類消毒劑，作為傳播媒介，可在社區(qū)及醫(yī)院內(nèi)引起水平傳播。艱難梭菌在石家莊地區(qū)住院腹瀉患者中的流行情況尚需進(jìn)一步積累資料，本研究通過收集近年來本地區(qū)成人住院腹瀉患者糞便并予以分離艱難梭菌，旨在了解艱難梭菌的流行及耐藥情況，為防控院內(nèi)CDI提供基線資料；另外，本研究將試探討艱難梭菌對利福霉素的耐藥機制。
　　方法：
　　1.2010年7

3、月-2011年12月、2012年8月-2013年12月和2015年1月-9月期間，收集河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院、河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院、河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院、河北省人民醫(yī)院成人住院腹瀉患者糞便共1013份。
　　2.采用厭氧富集芽孢法針對性培養(yǎng)糞便中的艱難梭菌，根據(jù)其菌落及鏡下形態(tài)，特殊氣味和生化反應(yīng)進(jìn)行確認(rèn)。
　　3.提取艱難梭菌基因組，多重 PCR擴增毒素基因確定其毒素型，擴增16S-23S rDNA基因間隔區(qū)并電泳，根據(jù)條帶

4、位置不同確定其PCR核糖體型別。
　　4.對分離得到的產(chǎn)毒艱難梭菌采用CLSI推薦的瓊脂稀釋法進(jìn)行藥敏試驗，共涉及到14種抗生素：左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、頭孢他啶、頭孢曲松、美羅培南、克林霉素、紅霉素、四環(huán)素、氯霉素、利福平、利福昔明、甲硝唑、萬古霉素和非達(dá)霉素。
　　5.本實驗室艱難梭菌菌庫中選取101株艱難梭菌，其中利福平耐藥69株，利福平中介4株，利福平敏感28株。提取基因組后進(jìn)行rpoB部分基因擴增并測序，與艱難梭菌6

5、30菌株rpoB基因比對后確定突變位置。
　　結(jié)果：11013份糞便標(biāo)本共分離出產(chǎn)毒艱難梭菌172株，陽性率為17.0%，其中168株tcdA+tcdB+cdtA-cdtB-，4株tcdA+tcdB+cdtA+cdtB+，未發(fā)現(xiàn)tcdA-tcdB+株。172株產(chǎn)毒艱難梭菌共分為34個PCR核糖體型別，其中HB6型最多，為43株，其次為HB5型30株，HB1型28株，三者共占58.7%（101/172），為本地區(qū)的優(yōu)勢型別；2本實驗

6、測定了14種抗生素對172株艱難梭菌的最小抑菌濃度（MIC），結(jié)果顯示，所有菌株對甲硝唑、萬古霉素和非達(dá)霉素均高度敏感，對環(huán)丙沙星、克林霉素、紅霉素、左氧氟沙星和四環(huán)素耐藥率較高，分別為98.8%，94.2%，77.3%，75%和35.5%。同為第三代喹諾酮類抗生素的左氧氟沙星，艱難梭菌對其敏感性稍高于環(huán)丙沙星；同樣，所有菌株對頭孢他啶耐藥，然而對頭孢曲松的耐藥率僅為26.7%。此外，該172株菌對利福平、利福昔明、氯霉素和美羅培南耐藥

7、率較低，分別為14.0%，14.0%，7.0%和2.3%；3將PCR核糖體型別與細(xì)菌耐藥譜聯(lián)合在一起分析時發(fā)現(xiàn)，主要型別 HB5、HB6和HB1型對抗生素的耐藥率較其他非流行型別高，在紅霉素組中，此耐藥率差異有統(tǒng)計學(xué)意義。HB5型對除頭孢他啶、甲硝唑、萬古霉素和非達(dá)霉素之外的其他十種抗生素的耐藥率均為各型別之首，在頭孢曲松、四環(huán)素、利福平和利福昔明中，該耐藥率差別有統(tǒng)計學(xué)意義。而且，對美羅培南耐藥的4株艱難梭菌的PCR核糖體型別均為HB

8、5型；對利福平耐藥的24株菌中，22株為 HB5型，僅有2株為其他型別（P＜0.001）；4101株艱難梭菌rpoB部分基因測序結(jié)果顯示，利福平耐藥株有rpoB突變，敏感株無突變。4株中介的艱難梭菌中2株有氨基酸改變，分別為D492Y，H502N。H502N&R505K、R505K&I548M為本地區(qū)耐藥株最常見的RpoB突變。分別出現(xiàn)在耐藥和中介菌株中的 H502D&D590V，D492Y為本研究新發(fā)現(xiàn)的與利福霉素耐藥有關(guān)的突變。

9、r>　　結(jié)論：
　　1.172株產(chǎn)毒艱難梭菌以tcdA+tcdB+cdtA-cdtB-為主，占97.7%，tcdA+tcdB+cdtA+cdtB+僅4株。HB6，HB5，HB1型為本地主要流行型別。分離菌株對氟喹諾酮類、頭孢菌素類和克林霉素耐藥率很高，應(yīng)警惕這三類抗生素應(yīng)用時誘發(fā)CDI；全部菌株對甲硝唑、萬古霉素和非達(dá)霉素敏感，可作為治療用藥；對利福平和利福昔明的耐藥率較低，可作為治療復(fù)發(fā)性CDI的備選用藥，但應(yīng)警惕HB5型別引起