鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥機(jī)制和分子流行病學(xué)研究.pdf

1、近年來非發(fā)酵菌在臨床分離的致病菌中呈增長趨勢，其中最重要的菌種是不動(dòng)桿菌和銅綠假單孢菌，不動(dòng)桿菌中又以鮑曼不動(dòng)桿菌最常見。不動(dòng)桿菌為條件致病菌，廣泛分布于水、土壤、醫(yī)院環(huán)境和人體的皮膚表面。目前，鮑曼不動(dòng)桿菌已成為繼銅綠假單孢菌、金黃色葡萄球菌之后的重要臨床分離致病菌。 目前不動(dòng)桿菌的基因分型方法有很多種，包括核酸分型、脈沖場凝膠電泳、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分析。其中脈沖場凝膠電泳（PFGE）是分型方式中的“金

2、標(biāo)準(zhǔn)”，目前已不僅僅是研究手段，還作為臨床菌株常規(guī)流行病學(xué)工具，發(fā)展了同種細(xì)菌的分型工具。 本研究對(duì)南方醫(yī)院05年至08年臨床收集的醋酸鈣-鮑曼不動(dòng)桿菌復(fù)合體的菌株進(jìn)行研究，首先用多重PCR技術(shù)快速鑒定出鮑曼不動(dòng)桿菌菌株，然后從外排泵、外膜蛋白、碳青霉烯類酶幾個(gè)方面探索其耐藥機(jī)制，并對(duì)其進(jìn)行分子流行病學(xué)分析和研究；所涉及的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和處理采用SPSS 13．0軟件。 第一部分、多重PCR方法進(jìn)行鮑曼不動(dòng)桿菌的快速鑒定研究

3、。 目的：鮑曼不動(dòng)桿菌是院內(nèi)感染的重要致病因素，快速鑒定有利于及時(shí)治療感染和預(yù)防暴發(fā)流行．本研究建立多重PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)快速鑒定鮑曼不動(dòng)桿菌，同時(shí)為之后的實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。 方法：本研究建立了多重PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物直接鑒定鮑曼不動(dòng)桿菌，同時(shí)設(shè)計(jì)的另一對(duì)不動(dòng)桿菌的通用引物亦可以鑒定不動(dòng)桿菌菌屬；2對(duì)引物放入一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，2%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。 結(jié)果：多重PCR分析南方醫(yī)院臨床分離的17

4、0株鮑曼不動(dòng)桿菌及鮑曼-醋酸鈣不動(dòng)桿菌的結(jié)果表明，整個(gè)過程所需時(shí)間約2小時(shí)左右。每一株菌株都擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)于recA基因的分子量大小約為425bp的片段序列，即能確定是屬于不動(dòng)桿菌屬；其中138株擴(kuò)增出片段大小約為208bp對(duì)應(yīng)于16sRNA基因的間隔區(qū)域（ITS）的片段序列，可確認(rèn)為鮑曼不動(dòng)桿菌，32株未擴(kuò)增出此序列的則應(yīng)該是醋酸不動(dòng)-鮑曼不動(dòng)桿菌復(fù)合體中其他不動(dòng)桿菌。 同時(shí)行陰性對(duì)照菌株大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、腸球菌、銅綠假單

5、孢菌等11只菌株的多重PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示未擴(kuò)增出任何一個(gè)目的片段，均為陰性結(jié)果。無擴(kuò)增產(chǎn)物。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，多重PCR技術(shù)可以較好地對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行鑒別，并能在2小時(shí)左右完成試驗(yàn)，該技術(shù)為鮑曼不動(dòng)桿菌的快速鑒定提供了又一可供選擇的手段，今后可以拓展對(duì)臨床菌株的快速鑒定，有利于及時(shí)有效的治療和院感控制暴發(fā)流行。 第二部分、耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌外排泵adeABC研究。 目的：外排泵系統(tǒng)是革蘭氏陰性桿菌

6、耐藥的重要機(jī)制之一，而在鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥機(jī)制中是否起作用尚存在分歧。本研究從外排泵表型和基因型兩個(gè)方面論證外排泵系統(tǒng)在鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥機(jī)制中所起的作用。 方法： 1．本研究通過主動(dòng)外排泵抑制劑羰基氰氯苯腙（CCCP）對(duì)138株鮑曼不動(dòng)桿菌的外排泵進(jìn)行了檢測，主動(dòng)外排泵表型檢測的陽性標(biāo)準(zhǔn)是加主動(dòng)外排泵抑制劑后美洛培南的最小抑菌濃度降低至少四倍以上； 2．選取61株鮑曼不動(dòng)桿菌菌

7、株，用熒光定量PCR測定了外排泵adeABC在61株菌中的表達(dá)情況。明晰外排泵在對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥機(jī)制中是否起作用；外排泵adeABC在該類抗生素的耐藥機(jī)制中是否起作用。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析分別采用卡方檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)，p<0．05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果： 1．泵抑制劑羰基氰氯苯腙（CCCP）和美羅培南協(xié)同實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示：使用CCCP之后，138株臨床分離菌中，CCCP抑制實(shí)驗(yàn)共篩選出泵陽性菌株28株，其中對(duì)美羅培南耐藥的39株菌

8、中有15株即38．4%的菌株的MIC降低了4倍或以上，為泵陽性株；對(duì)美羅培南敏感的99株菌中有13株即13．1%的菌株的MIC降低了4倍或以上，為泵陽性株。經(jīng)卡方檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有顯著意義。（x2=12．477b，P=0．01）； 2．熒光定量PCR檢測菌株的AdeB和16s rRNA后，根據(jù)檢測結(jié)果計(jì)算出各標(biāo)本的AdeB和16s rRNA的拷貝數(shù)，然后計(jì)算出表達(dá)量差異。經(jīng)t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示碳青霉烯類抗生素敏感組的Ad

9、eB的表達(dá)量是0．8991±1．17239，耐藥組的表達(dá)量是21．1010±21．44315，敏感組的表達(dá)量顯著低于耐藥組的表達(dá)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（t=4．403，P=0．000） 結(jié)論：提示主動(dòng)外排泵機(jī)制在南方醫(yī)院臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥機(jī)制中起作用。AdeB基因或者AdeABC外排泵機(jī)制可能在南方醫(yī)院臨床菌株對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥機(jī)制中起作用。 第三部分、耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌外膜蛋白C

10、arO機(jī)制研究。 目的：本研究在基因表達(dá)和蛋白表達(dá)兩個(gè)水平上檢測鮑曼不動(dòng)桿菌的外膜蛋白CarO在耐藥菌和敏感菌中表達(dá)量的差別，以明晰外膜蛋白CarO是否參與鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的機(jī)制。 方法：基因表達(dá)水平用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)外膜蛋白carO基因進(jìn)行表達(dá)量的檢測；蛋白表達(dá)水平的研究通過先制備和純化膜蛋白CarO的多克隆抗體，再利用western bloting技術(shù)對(duì)臨床收集的菌株進(jìn)行外膜蛋白CarO的檢測，

11、蛋白表達(dá)量用灰度值計(jì)算。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用t檢驗(yàn)。 結(jié)果： 1．根據(jù)熒光定量PCR的檢測結(jié)果計(jì)算出各標(biāo)本的carO和16s rRNA的拷貝數(shù)，然后計(jì)算出表達(dá)量差異。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示碳青霉烯類抗生素敏感組的carO的表達(dá)量為0．39±0．612，耐藥菌的carO的表達(dá)量為2．98±3．463，敏感菌carO的基因表達(dá)量顯著低于耐藥組carO的表達(dá)量，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； 2．成功制備外膜蛋白CarO的多克隆抗體；

12、western blot結(jié)果顯示用灰度值比較敏感菌和耐藥菌外膜蛋白CarO表達(dá)量，t檢驗(yàn)結(jié)果顯示敏感菌外膜蛋白CarO表達(dá)量為717．515±395．84，耐藥菌外膜蛋白CarO表達(dá)量為255．1033±23．26767，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著差異。（t=2．857，P=0．001） 結(jié)論：carO基因水平表達(dá)敏感菌表達(dá)量比耐藥菌表達(dá)量低，而蛋白水平表達(dá)CarO敏感菌表達(dá)量比耐藥菌表達(dá)量則高?？赡艿牟聹y是是否外界環(huán)境或其他因素比如藥物

13、作用對(duì)耐藥菌的菌體產(chǎn)生了某種影響，使細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄水平RNA不能正常地進(jìn)入翻譯的步驟進(jìn)行正常的翻譯，從而形成堆積。而敏感菌則由于外界環(huán)境未受影響，轉(zhuǎn)錄水平RNA可以正常地進(jìn)入翻譯狀態(tài)。 第四部分、耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌碳青霉烯酶OXA研究。 目的：本研究嘗試使用多重聚合酶鏈反應(yīng)即多重PCR的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，將所收集的96株鮑曼不動(dòng)桿菌菌株進(jìn)行OXA基因的檢測，區(qū)分鑒定編碼碳青霉烯類酶的四個(gè)OXA亞群的等位基因，從而研究各OXA類

14、碳青霉烯類酶在臨床菌株的分布狀況。 方法：通過設(shè)計(jì)OXA個(gè)亞群基因的多對(duì)引物，放入一個(gè)PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行聚合酶鏈擴(kuò)增反應(yīng)。 結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)研究顯示96株鮑曼不動(dòng)桿菌中，只攜有OXA-51的耐藥菌有9株，敏感菌有33株；同時(shí)攜有OXA-51和OXA-58兩個(gè)基因的耐藥菌株有38株，敏感菌株有6株；同時(shí)攜有OXA-51和OXA-23的耐藥菌和敏感菌各1株；8株菌未擴(kuò)增出OXA基因；未有單純攜帶OXA23和OXA58的菌株。

15、 結(jié)論：本研究結(jié)果顯示在近三年南方醫(yī)院的臨床菌株中，耐藥機(jī)制中OXA-51協(xié)同OXA-58起主要作用；與以往國內(nèi)的相關(guān)研究結(jié)果有比較大的差異，可能的原因是區(qū)域和收集菌株時(shí)間的不同造成了攜帶OXA基因的差異。 第五部分、南方醫(yī)院鮑曼不動(dòng)桿菌脈沖場凝膠電泳分析。 目的：本研究以南方醫(yī)院05年-08年臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌為研究對(duì)象，進(jìn)行脈沖場凝膠電泳（PFGE）分析，分析近三年南方醫(yī)院臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌的基因分型和

16、分布情況，為鮑曼不動(dòng)桿菌的分子流行病學(xué)研究和流行病學(xué)暴發(fā)流行控制提供基礎(chǔ)。 方法：采用脈沖場凝膠電泳對(duì)臨床分離的138株鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行分子流行病學(xué)研究，確認(rèn)這些菌株的親緣關(guān)系，并對(duì)臨床暴發(fā)流行分析。PFGE條帶判定結(jié)果的解釋：通過目測判定其帶型之間的關(guān)系，按照以下原則：（1）大多數(shù)流行病學(xué)相關(guān)帶型大小和數(shù)量相近的菌株被認(rèn)為是同一菌株（主流型），稱為A型（2）由于突變、插入、缺失或倒置的基因改變?cè)趲蜕嫌信c主要表型有1-3個(gè)差別

17、的菌株被認(rèn)為是主要型中的亞型，分別稱為A1、A2、A3；（3）帶型上有4或4個(gè)以上的不同之處，不能用1次或2次基因變化來解釋的，被認(rèn)為是不同的菌株，分別稱為B、C、D。 結(jié)果：根據(jù)脈沖場凝膠電泳分析，138株鮑曼不動(dòng)桿菌中有87株屬于同一菌株（主流型），本文將之稱為A克隆，時(shí)間跨度上從05年的菌株到08年的菌株都有該型；并且分布在不同的科室之間；其中條帶完全相同的有45株菌，條帶差異1-3條的有A1-A3克隆株有42株菌；B克隆