碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌耐藥機(jī)制研究.pdf

1、目的: 本研究通過了解我院鮑曼不動桿菌感染情況、耐藥特征與流行趨勢，研究重癥監(jiān)護(hù)病房臨床菌株與環(huán)境菌株耐藥特征，檢測耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌水解酶及外排泵基因，檢測主動外排系統(tǒng)結(jié)構(gòu)基因與調(diào)控基因在亞胺培南耐藥組(imipenem-resistant Acinetobacter baumannii IRAB)與敏感組(imipenem-sensitiveAcinetobacter baumannii ISAB)中分布差異，對主要外排基因進(jìn)

2、行表達(dá)量分析，并研究外膜蛋白Omp34介導(dǎo)鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類耐藥，深入探討鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類藥物的耐藥機(jī)制。
　　方法: 1、本實驗收集2012年7月到10月我院臨床分離鮑曼不動桿菌共78株，并采用ERIC-PCR及PFGE技術(shù)對該78株臨床分離株進(jìn)行同源性分析，了解本院鮑曼不動桿菌是否存在克隆株的播散流行。2、同期采用瓊脂稀釋法檢測神經(jīng)外科重癥監(jiān)護(hù)病房(Intensive Care Unit，ICU)27株臨床菌株和

3、28株環(huán)境菌株對常用抗菌藥物的最低抑菌濃度;用腸桿菌科基因間重復(fù)序列PCR(Enterbacteriat Repetitive IntergenicConsensus，ERIC-PCR)、多位點序列分型(Multi Locus Sequence Typing，MLST)及脈沖場凝膠電泳（Pulsed Field Gelelectrophoresis，PFGE）技術(shù)對共分離的55株鮑曼不動桿菌進(jìn)行基因分型，分析其可能的傳播途徑。3、采用聚

4、合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChain Reaction，PCR)檢測78株臨床菌株β-內(nèi)酰胺酶基因(OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58、IMP-1、VIM-1、VIM-2、Amp-C)及RND家族3個主要外排系統(tǒng)AdeABC、AdeIJK及AdeFGH結(jié)構(gòu)基因(adeB、adeJ、adeF、adeG、adeH)與調(diào)控基因(adeR、adeS、adeL)的攜帶情況，比較其在IRAB及ISAB中分布差異，進(jìn)一步使用

5、Realtime-PCR對其主要外排基因進(jìn)行表達(dá)量分析，初步探討鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類藥物的耐藥機(jī)制。4、研究通過采用雙重同源重組技術(shù)在鮑曼不動桿菌ATCC19606中構(gòu)建Omp34基因的缺失突變株(ATCC19606-△Omp34)，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白電泳分析外膜蛋白的表達(dá)，PCR法和基因測序進(jìn)一步驗證Omp34基因

6、敲除。比較野生株和敲除株對常用抗菌藥物尤其是碳青霉烯類的抑菌圈大小，以探討外膜蛋白Omp34在介導(dǎo)鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類耐藥中的作用。
　　結(jié)果: 1、臨床分離78株鮑曼不動桿菌只對米諾環(huán)素耐藥率稍低，為30.9％;其次為亞胺培南，耐藥率為53.1％;對其它抗菌藥物耐藥率均超過60％;對頭孢西丁、復(fù)方新諾明耐藥率最高，分別為97.5％、93.8％。78株鮑曼不動桿菌ERIC-PCR結(jié)果顯示可分為A、B、C、D、E、F6型，A型6

7、2株，為主要克隆株，其中A型又分為A1型46株，A2型16株，B型7株，C型6株，D、E、F型各1株。PFGE主要分為7型，A型56株（包括A1、A2、A3三個亞型），B型7株，C型4株，D型5株，E型3株，F(xiàn)型2株、G型1株。2、臨床分離27株鮑曼不動桿菌除對替加環(huán)素、粘菌素全部敏感，對其他14種抗菌藥物普遍耐藥，米諾環(huán)素耐藥率稍低，為25.9％。其次為頭孢哌酮/舒巴坦與亞胺培南，耐藥率分別為51.9％、59.3％，對其他抗菌藥物的耐

8、藥率均超過70％，對復(fù)方新諾明全部耐藥。環(huán)境分離28株鮑曼不動桿菌相比臨床分離菌株更為敏感，替加環(huán)素和粘菌素全部敏感，對美羅培南和頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率均為3.6％，對與亞胺培南耐藥率為7.1％，對米諾環(huán)素、哌拉西林/他唑巴坦耐藥率均為10.7％，對頭孢西丁耐藥率最高，為92.9％。27株臨床分離鮑曼不動桿菌ERIC-PCR基因分型主要為A、B、C三型，其中A型20株，B型6株，C型1株。28株環(huán)境分離鮑曼不動桿菌主要可分為6型，A型

9、13株，B型4株，C型2株，D型4株，E型2株，F(xiàn)型3株。27株臨床分離鮑曼不動桿菌MLST分為5個ST型(ST208，1-3-3-2-2-97-3;ST368,1-3-3-2-2-140-3; ST191,1-3-3-2-2-94-3; ST195,1-3-3-2-2-96-3; ST540,1-3-3-2-2-160-3)與4個新ST型。其中ST208是在神經(jīng)外科ICU中分布最為廣泛的基兇型，占到了菌株數(shù)的66.7％，環(huán)境菌株中ML

10、ST主要有2個ST型（ST208和ST229)。27株臨床分離菌株P(guān)FGE可分為5型，其中A型23株（包括A1型15株，A2型7株，A3型1株），B型1株，D型2株，E型1株，28株ICU環(huán)境分離株主要分為9型，其中A型15株（包括A1型7株，A2型2株，A3型6株），B型2株，C型1株，D型2株，E型3株，F(xiàn)型2株，G、H、I型各1株。3、在78株鮑曼不動桿菌中，均檢測到OXA-51，未檢測到OXA-24、OXA-58、VIM-1、V

11、IM-2基因。AmpC、OXA-23、IMP-1基因的檢測率分別為84.6％、74.3％、56.4％。66株檢測到Amp-C，其中42株為IRAB，22株ISAB。58株OXA-23陽性包括42株IRAB，12株ISAB。44株檢測到IMP-1，其中23株為IRAB，19株為ISAB。加入外排泵抑制劑PAβN，78株鮑曼不動桿菌分離株中，41株(52.5％)對亞胺培南的MICs有了4～32倍的降低，可認(rèn)為外排泵表型陽性。在AdeABC外

12、排系統(tǒng)中，adeB、adeS、adeR基因的檢出率為77％、77％、73％。60株adeB陽性菌株中，39株為IRAB，19株為ISAB。在78株臨床菌株中，檢測到adeJ基因72株(92％)，其中42株為IRAB，28株為ISAB。adeL、adeF、adeG和adeH的檢出率分別為94％、97％、90％和92％。70株adeG陽性菌株包括42株IRAB和26株ISAB。對8株IRAB和8株ISAB進(jìn)一步使用實時熒光定量PCR對主要外

13、排基因adeB、adeJ和adeG進(jìn)行表達(dá)量分析，經(jīng)統(tǒng)計分析adeB和adeG在IRAB和ISAB中表達(dá)量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。4、通過PCR試驗成功構(gòu)建ATCC19606-△Omp34基因敲除株，并通過基因測序驗證。SDS-PAGE蛋白電泳顯示，敲除株較野生株在34kDa處有一個蛋白缺失，說明Omp34基因敲除成功。藥物敏感性試驗結(jié)果顯示野生株和敲除株對碳青霉烯類抗生素的耐藥性沒有顯著改變。
　　結(jié)論: 我院神經(jīng)外科ICU鮑曼不動

14、桿菌對替加環(huán)素和粘菌素全部敏感，對米諾環(huán)素耐藥率稍低，其次為頭孢哌酮/舒巴坦和亞胺培南。臨床可根據(jù)藥敏結(jié)果選擇合適抗菌藥物。A型克隆株為我院鮑曼不動桿菌主要流行株，臨床菌株與環(huán)境菌株具有較高同源性，且同時分布于其他多個科室，科室間存在交叉感染的可能性，需采取切實有效的措施及時進(jìn)行干預(yù)。產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶Amp-C、OXA-23與主動外排系統(tǒng)AdeABC、AdeFGH過表達(dá)在鮑曼不動桿菌碳青霉烯耐藥中發(fā)揮重要作用。藥物敏感性實驗結(jié)果顯示野生