不動桿菌對碳青霉烯類耐藥機制的研究.pdf

1、目的：調(diào)查中國10家教學醫(yī)院臨床分離的不動桿菌屬對抗菌藥物的耐藥性；對碳青霉烯類耐藥的不動桿菌進行分子流行病學研究；研究不動桿菌對碳青霉烯類耐藥的分子機制，確定β內(nèi)酰胺酶、整合子、外膜蛋白(OMP)及外排泵在多重耐藥和泛耐藥不動桿菌屬中所起的作用。 方法：收集2003-2004年兩個年度北京、上海、廣州等十家教學醫(yī)院臨床分離的非重復的187株鮑曼不動桿菌，采用瓊脂稀釋法確定美羅培南、亞胺培南等抗菌藥物對這些菌株的最低抑菌濃度(M

2、IC)；同時收集1999-2004年的中國7家大型醫(yī)院臨床分離出的128株碳青霉烯類耐藥的不動桿菌(CRAB)，采用脈沖場凝膠電泳(PFGE)和隨機引物多態(tài)性DNA(RAPD)分型對這些菌株進行分子流行病學研究，確定這些耐藥株的親緣關(guān)系，并對北京協(xié)和醫(yī)院CRAB的暴發(fā)流行進行臨床回顧性分析；選取10個不同的耐藥克隆株深入研究碳青霉烯類的耐藥機制；等電聚焦電泳測定β內(nèi)酰胺酶的等電點，抑制試驗確定酶的類型；堿裂解法提取質(zhì)粒；接合試驗確定碳青

3、霉烯類的耐藥基因能否轉(zhuǎn)移；對β內(nèi)酰胺酶基因TEM、SHV、PER、CTX-M。VEB、GES和碳青霉烯酶基因IMP-、VIM-、OXA-23亞組、OXA-24亞組進行聚合酶鏈式反應(PCR)及序列分析；對整合子可變基因進行PCR及全長的序列分析。采用12％十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析CRAB菌株的Omp。 采用利血平抑制試驗檢測外排泵的表達情況。體外在亞MIC濃度的亞胺培南的選擇壓力下，對全敏感株4

4、As6、三代頭孢菌素耐藥株32號菌進行突變篩選研究，比較母體株和突變子耐藥機制的差異，確定各種耐藥機制所起的作用。 結(jié)果:2003～2004年來自中國10家教學醫(yī)院的數(shù)據(jù)顯示，碳青霉烯類美羅培南、亞胺培南的敏感性明顯降低，從2003年的92％降至2004年的80％，其他藥物的敏感性也在降低。頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶、頭孢吡肟、阿米卡星、環(huán)丙沙星的敏感率40.4％-51.5％。對3個以上不同類抗菌藥物耐藥的菌

5、株從2003年的33％升至2004年的48％。北京、廣州、福州、杭州、濟南的8家醫(yī)院均發(fā)現(xiàn)GRAB耐藥克隆的暴發(fā)流行，但這些醫(yī)院流行的耐藥克隆的遺傳背景是不同的。2004年北京協(xié)和醫(yī)院發(fā)生泛耐藥株P(guān)克隆的暴發(fā)流行，此克隆株波及18個病房的74個患者，近59.4％的患者(44例)為感染，主要引起肺部感染和菌血癥，其中菌血癥的死亡率40.2％。此克隆株不同于本院過去出現(xiàn)的耐藥克隆。對常用廣譜抗菌藥物均不敏感，僅黏菌素高敏。此10個克隆株均產(chǎn)

6、多種β內(nèi)酰胺酶：OXA-23型碳青霉烯酶(9個克隆株)、IMP-8型金屬酶(1株)、PER-1型酶超廣譜β內(nèi)酰胺酶(1株)、高產(chǎn)AmpC酶(10個)、SHV型酶、TEM-1酶及等電點為6.0的酶。這10個克隆株對碳青霉烯類、絕大多數(shù)超廣譜頭孢菌素類及青霉素類、紅霉素、氯霉素、利福平均耐藥，2個克隆株對頭孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星敏感，5個克隆株對左氧氟沙星敏感。所有10個克隆株對米諾環(huán)素、黏菌素較為敏感。共發(fā)現(xiàn)5種不同結(jié)構(gòu)的整合子，攜帶水

7、解氨基糖苷類、利福平、氯霉素及金屬酶(blaIMP-8)的耐藥基因。大多數(shù)OXA-23型酶的編碼基因位于染色體上，接合試驗未能將碳青霉烯類耐藥性轉(zhuǎn)入受體菌。不同克隆株OMP差異很大。利血平試驗未發(fā)現(xiàn)外排機制的高表達。體外試驗在亞胺培南的亞MIC選擇壓力下，從一株全敏感株4As6選擇出多重耐藥的突變株(4As6-3)。OMP20kDa的缺失，OMP29kDa、OMP21kDa的表達降低是突變子耐藥的主要原因。 結(jié)論:在中國，不動桿

8、菌產(chǎn)生的碳青霉烯酶最常見的是OXA-23型酶。CRAB克隆株的傳播是造成中國多家醫(yī)院碳青霉烯類耐藥率增加的重要原因，每家醫(yī)院均發(fā)現(xiàn)CRAB株的暴發(fā)流行。各家醫(yī)院流行的克隆株是不同的。CRAB株引起的感染預后差，必須采取有效的感染控制措施和抗菌藥物的干預政策以控制耐藥株的傳播。不動桿菌通過產(chǎn)生多種β內(nèi)酰胺酶(特別是OXA-23型碳青霉烯酶或IMP型金屬酶)、攜帶有不同基因盒的整合子、外膜孔蛋白多個通道的缺失，共同介導多重耐藥性或泛耐藥性。