腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　本研究擬通過(guò)對(duì)四川省某三甲醫(yī)院臨床分離的60株多重耐藥的腸桿菌科細(xì)菌耐藥譜進(jìn)行分析,篩選出對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的腸桿菌科細(xì)菌10株進(jìn)行碳青霉烯酶表型、耐藥基因、外膜蛋白的檢測(cè)以及檢測(cè)整合子和質(zhì)粒結(jié)合試驗(yàn)的研究，旨在闡明腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的主要機(jī)制以及細(xì)菌耐藥性的水平傳播能力，對(duì)指導(dǎo)臨床合理使用抗生素，減少耐藥菌株的產(chǎn)生、控制和預(yù)防耐藥菌株的流行提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　1.收集四川省

2、某三甲醫(yī)院2010年1月-2011年5月臨床分離的多重耐藥的腸桿菌科細(xì)菌。2.用瓊脂稀釋法檢測(cè)多重耐藥的腸桿菌科細(xì)菌對(duì)13種抗生素的最低抑菌濃度(MIC),分析其耐藥譜,篩選出對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的腸桿菌科細(xì)菌。3.改良Hodge試驗(yàn)篩查對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥菌株產(chǎn)碳青霉烯酶的情況。4.EDTA雙紙片協(xié)同試驗(yàn)篩查對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥菌株產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶情況。5.利用聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,

3、 PCR)技術(shù)檢測(cè)耐碳青霉烯類抗生素菌株耐藥基因,其測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。6.膜孔蛋白逆轉(zhuǎn)錄Real-time PCR分析耐藥株膜孔蛋白的表達(dá)情況。7.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增耐碳青霉烯類抗生素菌株整合子并分析其基因序列。8.利用質(zhì)粒結(jié)合試驗(yàn)研究耐碳青霉烯類抗生素菌株耐藥性的水平傳播能力。
　　結(jié)果：
　　1.收集60株四川某三甲醫(yī)院臨床分離的多重耐藥的腸桿菌科細(xì)菌。2.本研究利用瓊脂稀釋法藥敏試驗(yàn)對(duì)60株臨床分

4、離的多重耐藥的腸桿菌科細(xì)菌的耐藥譜進(jìn)行分析,有10株細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥,其中包括:5株肺炎克雷伯菌,4株陰溝腸桿菌和1株植生拉烏爾菌。多重耐藥菌株中對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥菌株的分離率為16.67％。這10株細(xì)菌對(duì)厄他培南、美羅培南、亞胺培南的耐藥率分別為100％、70％、10％。對(duì)頭孢曲松鈉、頭孢他啶、和頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率均為100％,頭孢西丁鈉和頭孢吡肟的耐藥率分別為90％、80％。對(duì)阿米卡星和多粘菌素B的敏感率最高,分

5、別為90％和80％。3.改良Hodge試驗(yàn)在10株耐碳青霉烯類抗生素細(xì)菌中檢測(cè)有7株陽(yáng)性,菌株分別為K13、K25、K30、E3、E8、E13和R1。4.EDTA雙紙片協(xié)同試驗(yàn)檢測(cè)在10株耐碳青霉烯類抗生素細(xì)菌中有4株陽(yáng)性,菌株分別為K13、K17、E3和R1。5.在10株菌中共檢出6種耐藥基因,碳青霉烯酶相關(guān)基因IMP、KPC陽(yáng)性株數(shù)分別為4株(40％)、1株(10％);編碼超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)基因CTX、TEM、SHV的

6、陽(yáng)性株數(shù)分別為10株(100％)、5株(50％)、8株(80％);AmpC酶相關(guān)基因DHA2株(20％)陽(yáng)性。經(jīng)GenBank比對(duì)碳青霉烯酶基因4株IMP酶為IMP-4型,1株KPC酶為KPC-2型;超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因檢出較多的是 CTX-M3、TEM-1、SHV-12和SHV-28;AmpC酶相關(guān)基因?yàn)镈HA-1。6.利用逆轉(zhuǎn)錄Real-time PCR對(duì)膜孔蛋白的分析發(fā)現(xiàn)有2株肺炎克雷伯桿菌的膜孔蛋白o(hù)mpK36的表達(dá)量下降,有

7、3株陰溝腸桿菌的膜孔蛋白 ompF的表達(dá)量下降。7.整合子擴(kuò)增有7株陽(yáng)性,且擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后分析其序列證實(shí)均為I類整合子,較多的基因盒組合為dfrA12-orfF-aadA2。較常見(jiàn)的耐藥基因?yàn)榘被擒疹惪股啬退幓?aadA2和aadA16),其次為甲氧芐啶耐藥基因(dfrA12、dfr16和dfrA27)。8.在這10株研究的細(xì)菌中對(duì)5株攜帶碳青霉烯酶基因的細(xì)菌進(jìn)行結(jié)合試驗(yàn),有4株產(chǎn)IMP-4的腸桿菌結(jié)合成功。結(jié)合子的藥敏結(jié)果與其

8、供體菌的藥敏結(jié)果相似;EDTA協(xié)同試驗(yàn)篩查4株結(jié)合子均產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶;4株結(jié)合子的質(zhì)粒大小相近。
　　結(jié)論：
　　1.本研究在60株臨床分離的多重耐藥的腸桿菌科細(xì)菌中篩選出10株對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥。這10株細(xì)菌對(duì)頭孢菌素類抗生素耐藥較高,而對(duì)阿米卡星和多粘菌素B保持較高的活性。
　　2.對(duì)10株耐碳青霉烯類抗生素細(xì)菌耐藥機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn):產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶合并產(chǎn)ESBLs和膜孔蛋白表達(dá)下降合并產(chǎn)ESBLs是細(xì)菌耐