東北5家醫(yī)院碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌耐藥機制及臨床感染特點研究.pdf

1、目的：
　　隨著抗菌藥物廣泛而不規(guī)范的應用，細菌耐藥的情況越來越嚴峻，世界范圍內碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE)開始出現(xiàn)廣泛蔓延的趨勢。近5年來全國范圍，尤其是江浙地區(qū)，CRE菌株的檢出率快速增長至10％以上，而東北地區(qū)CRE菌株檢出率一直偏低(0～3％)，但是近兩年CRE菌株分離率迅猛上升。
　　由于抗菌藥物使用受到藥物供應、用藥習慣以及用

2、藥水平的影響，細菌耐藥的特征往往具有地域差異，而國內對于CRE耐藥菌株的研究主要集中于江浙地區(qū)，東北區(qū)域的相關報道較少。因此需要全面分析本地區(qū)CRE菌株的耐藥特點，在此基礎上探索“老藥新用”——磷霉素聯(lián)合其他藥物對CRE的抗菌活性，為臨床優(yōu)化抗菌藥物選擇，進行CRE感染精準治療提供科學數(shù)據(jù)。
　　本地區(qū)CRE耐藥菌從無到有，并呈快速上升趨勢，有必要深入研究本地區(qū)CRE菌株的耐藥機制和分子流行病學特征，探尋耐藥菌的流行病學規(guī)律，為感

3、控部門采取有效措施防治本地CRE耐藥菌的播散流行提供參考依據(jù)，進而為防控耐藥菌在世界范圍內蔓延提供有益的線索。
　　方法：
　　1、本研究收集2013年1月至2015年6月期間東北地區(qū)5家醫(yī)院（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院、中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院、遼寧省人民醫(yī)院、大連市醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院、哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院）臨床分離的85株CRE菌株，進行菌株鑒定，采用微量肉湯稀釋法測定13種抗菌藥物對受試菌株的藥物敏感性。同時通過

4、體外藥敏試驗研究磷霉素與其他抗生素聯(lián)合對CRE體外抗菌活性。
　　2、分別通過改良Hodge試驗、EDTA協(xié)同試驗進行碳青霉烯酶的表型檢測，應用PCR基因擴增技術及DNA測序方法對受試菌株進行碳青霉烯酶基因型的檢測，同時以PCR檢測結果為金標準比較其他兩種碳青霉烯酶檢測方法。
　　3、通過對受試菌株中肺炎克雷伯桿菌進行多位點序列分型(multilocussequence typing，MLST)，探討其克隆相關性和分子流行病

5、學特征。同時分析不同ST分型下碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯桿菌的耐藥表型、耐藥機制及菌株感染的臨床特點。
　　結果：
　　1、本研究共收集到碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌85株，以肺炎克雷伯桿菌為主(61/85，71.8％)，藥敏結果顯示對大多數(shù)臨床常用抗菌藥物均耐藥，耐藥率最低的是多粘菌素(21.2％)和替加環(huán)素(20.5％)。以磷霉素為基礎的體外聯(lián)合藥敏試驗提示磷霉素與美羅培南、替加環(huán)素聯(lián)合以協(xié)同相加作用為主，磷霉素聯(lián)合阿米卡星或

6、多粘菌素以無關和相反作用為主。
　　2、85株CRE中改良Hodge試驗和EDTA協(xié)同試驗陽性菌株分別為49株、12株。經(jīng)PCR檢測共檢出64株產碳青霉烯酶基因分別為KPC-2(53/85，62.4％)、IMP-4(10/85,11.8％)、NDM-5(7/85,8.2％)、NDM-6(1/85,1.2％)。以PCR為金標準，改良Hodge試驗對85株CRE菌株中碳青霉烯酶檢出靈敏度和特異性分別為83.0％(44/53)、84.4

7、％(27/32)，EDTA協(xié)同試驗對18株產金屬酶菌株的靈敏度和特異性分別為55.6％(10/18)、97.0％(65/67)。
　　同時采用了PCR和DNA測序分析對85株CRE菌株進行了超廣譜β-內酰胺酶（Extended-Spectrumβ-Lactamases，ESBLs）基因檢測，產CTX-M-1組ESBLs的菌株有37株，產CTX-M-9組ESBLs的菌株有21株，未檢測出TEM型及SHV型酶。結合碳青霉烯酶基因的檢測

8、結果顯示，共有35株產碳青霉烯酶的CRE菌株同時攜帶超廣譜β-內酰胺酶，其中KPC酶合并CTX-M-1組ESBLs菌株數(shù)最多（14株），其次為IMP酶合并CTX-M-9組ESBLs（5株）。
　　3、MLST分型顯示61株碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantEnterobacteriaceae-Klebsiella pneumoniae，CRE-KPN)共有18種ST分型，ST11為優(yōu)勢型別(53

9、.3％)，研究同時發(fā)現(xiàn)這部分ST11型菌株更容易對碳青霉烯類抗生素耐藥且MIC值較高，大部分攜帶KPC-2型碳青霉烯酶。其他序列型中ST2033、ST2135、ST2193、ST2194、ST2195、ST2196為世界范圍內首次注冊，其中eBURST分析提示ST2193、ST2194、ST2195與ST11有很密切的親緣性。結合臨床資料發(fā)現(xiàn)同一家醫(yī)院同一時期以相同克隆流行為主。
　　臨床資料分析提示CRE-KPN感染的患者年齡偏

10、大，大多數(shù)接受過ICU的治療，67.4％的患者同時合并感染多種耐藥菌株，菌株分離前使用最多的抗菌藥物為三代頭孢菌素及酶抑制劑復合制劑(88.4％)和碳青霉烯類抗菌藥物(60.5％)。單因素分析提示ST11組患者在重癥監(jiān)護病房接受治療所占的比例及機械通氣的使用率高于非ST11組，具有統(tǒng)計學差異。
　　結論：
　　東北5家醫(yī)院臨床分離的CRE菌株以肺炎克雷伯桿菌為主，對大多數(shù)抗生素耐藥，其中對于CRE指南推薦的替加環(huán)素和多粘菌素

11、也存在20％的耐藥率，臨床可以選擇的抗菌藥物極其有限。在此基礎上進行的體外聯(lián)合藥敏試驗發(fā)現(xiàn)磷霉素—美羅培南、磷霉素—替加環(huán)素體外聯(lián)合具有良好的抗菌活性，為探索本地區(qū)碳青霉烯類耐藥腸桿菌感染臨床治療提供了積極的指導意義。
　　本地區(qū)CRE菌株以產KPC-2型碳青霉烯酶為主，接近50％的產碳青霉烯酶菌株同時攜帶超廣譜β-內酰胺酶，其中KPC酶合并CTX-M-1組ESBLs菌株數(shù)最多，其次為IMP酶合并CTX-M-9組ESBLs，復雜的

12、耐藥機制給臨床耐藥菌的防控增加了難度。
　　多位點序列分型研究發(fā)現(xiàn)本地區(qū)碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌共有18種ST型別，以ST11為主，其中有6個新的ST型別(ST2033、ST2135、ST2193、ST2194、ST2195、ST2196)為世界范圍內首次報道，同時eBURST分析發(fā)現(xiàn)ST2193、ST2194、ST2195與ST11有很密切的親緣性。新型ST的發(fā)現(xiàn)提示CRE-KPN存在克隆性和多樣性，應給予密切關注和監(jiān)測。結合