耐碳青霉烯類(lèi)藥物鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制研究.pdf

1、 目的 本研究擬通過(guò)對(duì)本院臨床分離的 40 株鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥譜進(jìn)行分析,篩選出對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物耐藥的菌株,用聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)技術(shù)檢測(cè)碳青霉烯酶耐藥基因,旨在闡明鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物耐藥的主要機(jī)制,對(duì)指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物,預(yù)防和控制碳青霉烯類(lèi)耐藥菌株的流行提供科學(xué)依據(jù)。同時(shí)采用差異蛋白組學(xué)的方法,利用SELDI-TOF-MS技術(shù)檢測(cè)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物耐藥和

2、敏感菌株蛋白指紋圖譜,結(jié)合聚類(lèi)分析探索其用于查找碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物耐藥菌株親緣性遠(yuǎn)近的臨床價(jià)值。方法 1. 收集本院2011年1月~2012年12月臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌株。2.使用MicroScan WalkAway96 全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏測(cè)試系統(tǒng)鑒定,并通過(guò)儀器檢測(cè)其對(duì)妥布霉素、復(fù)方新諾明、哌拉西林、氨芐西林-舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢曲松、阿米卡星、頭孢他啶、環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、頭孢吡肟、慶大霉素、加替沙星、亞胺培南、左

3、氧氟沙星等的最低抑菌濃度(MIC),分析其耐藥情況,篩選出對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌。3.用聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)技術(shù)檢測(cè)碳青霉烯類(lèi)相關(guān)耐藥基因 IMP、VIM 、OXA-23、OXA-24、OXA-58,然后對(duì) PCR 擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物電泳并成像,對(duì)PCR擴(kuò)增陽(yáng)性的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,把測(cè)序結(jié)果與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。4.對(duì)所有40株鮑曼不動(dòng)桿菌菌株先破壞細(xì)菌提取蛋白質(zhì)

4、,再用SELDI-TOF-MS技術(shù)及Au蛋白芯片檢測(cè)細(xì)菌蛋白質(zhì)指紋圖譜。5. 用Biomarker Wizard 3.1 軟件進(jìn)行分析獲得的細(xì)菌蛋白質(zhì)圖譜,篩選出碳青霉烯類(lèi)抗菌耐藥和敏感鮑曼不動(dòng)桿菌菌株相關(guān)差異表達(dá)蛋白,用SPSS 19.0對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行聚類(lèi)分析,追溯其臨床感染的親緣性。結(jié)果 1.分離本院臨床標(biāo)本共獲得40株鮑曼不動(dòng)桿菌。2.對(duì)40株臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥譜進(jìn)行分析,獲得對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物耐藥鮑

5、曼不動(dòng)桿菌22株,耐藥率為55%,這22株碳青霉烯類(lèi)藥物耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)臨床常用抗菌藥物耐藥率為100%。3.在22株碳青霉烯類(lèi)藥物耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥基因中,OXA-23 陽(yáng)性有 16 株,陽(yáng)性率為72.7%, OXA-58陽(yáng)性有5株,陽(yáng)性率為22.7%, VIM陽(yáng)性有7株,陽(yáng)性率為31.8%,1株同時(shí)攜帶OXA-23、OXA-58 和VIM基因,陽(yáng)性率為4.5%, 3 株同時(shí)攜帶 OXA-23 和 OXA-58 基因,陽(yáng)性率為13

6、.6%,7 株同時(shí)攜帶OXA-23和VIM基因,陽(yáng)性率為31.8%；未檢測(cè)到基因OXA-24和IMP。OXA-23、OXA-58、VIM基因擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST程序?qū)Ρ确治雠cNCBI的相應(yīng)基因序列的同源性分別為99%、99%和97-99%。4. 通過(guò)SELDI-TOF-MS對(duì)結(jié)合在Au芯片上的鮑曼不動(dòng)桿菌蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè),獲得所有鮑曼不動(dòng)桿菌蛋白質(zhì)指紋圖,通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)碳青霉烯類(lèi)耐藥和敏感的鮑曼不動(dòng)桿菌菌株間蛋白質(zhì)譜的表達(dá)具

7、有顯著性差異(P<0.05)。5. 對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌質(zhì)譜結(jié)果聚類(lèi)分析,結(jié)果顯示碳青霉烯類(lèi)藥物耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌在院內(nèi)的分布以A型為主,B型次之。結(jié)論1. 鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物耐藥率比較高,尤其亞胺培南為55%。其余常用 14 種抗菌藥物的耐藥率均在 70%以上。2. 碳青霉烯類(lèi)耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌OXA-23基因陽(yáng)性率為72.7%,說(shuō)明攜帶OXA-23基因可能為鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物耐藥的主要原因之一,另

8、外有 1株攜帶OXA-23、OXA-58 和VIM基因,3株攜帶OXA-23和OXA-58基因,7株攜帶OXA-23和VIM基因,說(shuō)明多種耐藥基因的攜帶是鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)臨床常用抗菌藥物耐藥的重要原因。3. 碳青霉烯類(lèi)耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌有特征性的蛋白質(zhì)指紋圖。經(jīng)過(guò)聚類(lèi)分析顯示碳青霉烯類(lèi)藥物耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌的分布以A型為主,B型次之,A型分為A1和A2兩個(gè)亞型,并以A1為主,B型也分為B1,B2,并以B2為主。碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物耐藥的鮑曼不