遼寧地區(qū)近五年碳青霉烯類藥物耐藥的鮑曼不動桿菌耐藥分子特征研究.pdf

1、目的:研究碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的鮑曼不動桿菌(CRAB)編碼碳青霉烯酶的主要耐藥基因類型，包括編碼絲氨酸蛋白酶（A類酶）、苯唑西林水解酶（D類酶）以及金屬酶（B類酶）的基因類型。明確本地區(qū)CRAB的臨床分布特征及耐藥的分子機(jī)制，為治療和控制CRAB感染提供理論參考依據(jù)。
　　研究方法:1、研究對象:中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科2011年1月至2015年12月無菌體液標(biāo)本分離培養(yǎng)獲得的57株CRAB菌株。
　　2、主要試劑

2、及儀器:VITEK-2全自動微生物分析系統(tǒng)及鑒定卡;法國梅里埃生物公司的抗菌藥物藥敏卡;日本TakaRa公司的DNA提取試劑盒;美國ABI公司的9700型PCR擴(kuò)增儀;美國Alpha Innotech有限公司的紫外凝膠成像儀;BIO-RAD電泳儀。PCR所有引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。
　　3、菌株鑒定和藥敏試驗:采用VITEK-2全自動微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行菌株鑒定和藥敏分析，并通過Whonet5.6分析軟件對結(jié)果進(jìn)行分析

3、處理。藥敏結(jié)果依據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI) M100-22標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。
　　4、核酸DNA提取:將菌株接種到血平板37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，應(yīng)用TakaRaminiBEST Bacterial Genomic Extraction DNA試劑盒提取57株CRAB菌株DNA各200μL。
　　5、耐藥基因檢測:采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測CRAB中編碼碳青霉烯酶的耐藥基因包括A類酶:blaPER-1;B類酶:b

4、laVIM和blaIMP;D類酶:blaOXA-51，blaOXA-23，blaOXA-24，blaOXA-58。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5％的瓊脂糖凝膠電泳分析，電泳結(jié)束后在紫外凝膠成像儀下觀察目的基因條帶，并拍照成像。
　　6、基因測序: PCR產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)公司，經(jīng)純化后應(yīng)用DNA測序儀進(jìn)行基因序列測定。測序結(jié)果與網(wǎng)上基因庫已知的碳青霉烯酶基因型序列作blast比對（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bl

5、ast），一致程度達(dá)到98％以上的基因序列則可判斷為相同基因型。
　　結(jié)果:1、CRAB菌株的來源及科室分布:CRAB菌株主要存在于血液(58％)，其它依次為腦脊液(21％)，引流液(10.5％)、膿汁(8.8％)及分泌物(1.7％)。CRAB菌株的科室分布以外科ICU的檢出率最高(59.6％)，其次為神經(jīng)外科(19.3％)。2、CRAB藥敏結(jié)果:57株CRAB中除碳青霉烯類抗菌藥物全部耐藥外，對其它β-內(nèi)酰胺類藥物和四環(huán)素耐藥率

6、達(dá)90％以上，對氨基糖甙類和喹諾酮類的耐藥率均超過60％。3、57株CRAB碳青霉烯酶基因型:CRAB攜帶D類酶blaOXA-51的檢出率為100％，blaOXA-23的檢出率為96.5％;blaOXA-24的檢出率為12.3％，其中3.5％的CRAB菌株單獨攜帶blaOXA-24耐藥基因，8.8％的CRAB同時攜帶blaOXA-24與blaOXA-23耐藥基因;未發(fā)現(xiàn)攜帶blaOXA-58基因的CRAB菌株;A類酶基因型:blaPER

7、-1的檢出率為5.3％，全部與blaOXA-23以聯(lián)合耐藥的形式存在;未發(fā)現(xiàn)B類酶中攜帶blaVIM或blaIMP基因的菌株。
　　結(jié)論:1、本地區(qū)CRAB碳青霉烯酶基因型主要為baOXA-23，它可以與同類碳青霉烯酶blaOXA-24或不同類型的碳青霉烯酶blaPER-1之間出現(xiàn)聯(lián)合耐藥。2、部分CRAB菌株攜帶blaOXA-24基因，尚未出現(xiàn)廣泛流行。3、未發(fā)現(xiàn)攜帶blaOXA-58基因的CRAB菌株。4、未發(fā)現(xiàn)攜帶金屬酶基因