碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌的分子生物學及其臨床感染特征研究.pdf

1、細菌耐藥性目前己成為全球性關注的問題,耐藥細菌所致感染已構成新世紀抗感染治療的新挑戰(zhàn),是當前人類健康和生命面臨的主要威脅。腸桿菌科細菌分布廣,與人類關系密切。在醫(yī)院感染中,腸桿菌科細菌包括大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌等是引起醫(yī)院感染最常見的病原菌,并以多重耐藥菌株引起的感染為顯著特點。碳青霉烯類抗生素是目前臨床治療產超廣譜β-內酰胺酶(Extended Spectrum β-Lactamases,ESBLs)及AmpC酶等多重耐藥菌株所引起

2、感染的最有效的抗菌藥。但隨著該類抗生素在臨床上的廣泛應用及不合理使用,臨床上已出現(xiàn)對碳青霉烯類抗生素耐藥的菌株。目前國內外關于腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥機制報道主要集中在四個方面:
　?、佼a生碳青霉烯酶,如IMP型和VIM型金屬酶以及KPC(Klebsiella pneumoniae carbapenemase,KPC)型碳青霉烯酶等;
　?、贓SBL和/或AmpC酶過度表達同時合并外膜孔蛋白的丟失;
　?、?/p>

3、外排泵高表達的膜屏障機制;
　　④藥物靶位改變。
　　在上述幾種耐藥機制中,產碳青霉烯酶是腸桿菌科細菌對碳青霉烯類耐藥最主要的機制。駱俊等人對2003年6月到2004年5月華山醫(yī)院臨床分離的耐亞胺培南的革蘭陰性桿菌中的碳青霉烯酶進行了篩查,發(fā)現(xiàn)細菌產碳青霉烯酶是不動桿菌和弗勞地檸檬酸桿菌對亞胺培南和美羅培南等碳青霉烯類抗生素耐藥的主要原因之一。沈繼錄等人采用瓊脂稀釋法測定亞胺培南和美羅培南對199株革蘭陰性桿菌的最低抑菌濃度

4、(MIC),結果顯示耐碳青霉烯類革蘭陰性桿菌對12種抗生素的耐藥率均高于碳青霉烯類敏感革蘭陰性桿菌的耐藥率,而且產生多種碳青霉烯酶,如KPC、IMP、VIM和OXA型碳青霉烯酶等,并在弗勞地檸檬酸桿菌、鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌中有產酶克隆株的流行。在巴西,腸桿菌科細菌中對碳青霉烯耐藥已成為主要問題,特別是產KPC酶的耐藥株己在多個地區(qū)報道?！读~刀》報道的產NDM-1酶的超級細菌在大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中最多見,并且已傳播到印度以外

5、的國家。
　　雖然腸桿菌科細菌可通過產生金屬酶而對碳青霉烯類抗生素耐藥,但此類菌株的檢出率極少。自2001年報道第一株產KPC酶的肺炎克雷伯菌以來,有關碳青霉烯酶尤其是KPC酶的研究目前己成為國際關注焦點,世界各地不斷出現(xiàn)此類菌株引起的醫(yī)院感染的報告,其檢出率亦呈快速上升的趨勢。2005年-2008年華山醫(yī)院臨床分離的肺炎克雷伯菌對亞胺培南、美羅培南和厄他培南等抗菌藥的耐藥率均在2％以下,但2009年快速上升至13％左右;2010

6、年更是上升為26.3％。弗勞地檸檬酸桿菌2005年對碳青霉烯類抗生素的耐藥率在1O％,2006年快速上升至45％左右,2007年-2009年維持在35％左右。進一步的資料分析結果顯示,華山醫(yī)院臨床分離的對碳青霉烯類抗生素耐藥的腸桿菌科細菌中,大部分菌株集中于神經外科病房和重癥ICU病房。由于KPC酶基因往往位于質粒上,該質粒同時亦可攜帶多種對其他抗菌藥耐藥的基因,因此產KPC酶的菌株往往具有高度的耐藥性和廣泛的播散性,臨床上對該類菌株引

7、起的感染治療是一個棘手的問題。
　　基于此,本課題對2009年4月到2010年2月期間華山醫(yī)院臨床分離的82株對碳青霉烯類抗生素耐藥的腸桿菌科細菌(Carbapenem-Resislant Enterobacteriaceae,CRE)進行了分子生物學及其臨床感染特征的研究,以明確本院CRE菌株的耐藥現(xiàn)狀、耐藥機制、傳播機制及其感染的危險因素。為針對CRE感染的抗生素合理選用提供依據,這對及時遏制CRE菌株引起的持續(xù)感染和暴發(fā)流行

8、,降低醫(yī)院感染的發(fā)生率和病死率有重要意義。本研究內容共包括以下四部分。
　　第一部分碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌的藥敏試驗及其同源性分析
　　為了解華山醫(yī)院腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥性,我們收集了2009年4月到2010年2月的1561株腸桿菌科細菌,采用紙片擴散法對收集的菌株進行耐藥譜的初步分析,并根據2010年更新版的CLSI(Clinical and Laboratory Standsrd Institute)

9、文件中各類抗生素對腸桿菌科細菌藥敏試驗結果判定標準,顯示1561株腸桿菌科細菌中肺炎克雷伯菌最常見,共檢出604株(38.7％),其中有113株CRE菌株;其次是大腸埃希菌,共檢出581株,其中有12株CRE菌株。在1561株腸桿菌科細菌中,奇異變形桿菌和陰溝腸桿菌各占5％左右,且18.1％的陰溝腸桿菌為CRE菌株;粘質沙雷菌、斯氏普羅威登菌、摩根摩根菌、產酸克雷伯菌、普通變形桿菌、產氣腸桿菌和雷氏普羅威登菌的菌株比例在1-4％之間;其

10、余的菌株比例都在1％以下。細菌檢出以呼吸道和尿路為主要來源,各占46.4％(725/1561)和34.6％(540/1561)。男性患者有862位,女性患者有673位,另有26位信息缺失?；颊咧饕獮?0-80歲的中老年人,占59.4％(927/1561)。
　　按照2009年版CLSI文件標準,除個別菌株保存不佳外,細菌經分離純化培養(yǎng),最后共收集有82株CRE菌株作為本組受試菌株,包括68株肺炎克雷伯菌(Klebsiella pn

11、eumoniae、KPN)、3株大腸埃希菌(Escherichia coli、ECO)、3株陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae、ECL)、4株弗勞地檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii、CFR)、1株產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes、EAE)、1株斯氏普羅威登菌(Providencia stuartii、PST)、1株丙二酸鹽檸檬酸桿菌(Citrobacter,malonate、

12、CML,)和1株產酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca、KOX)。采用瓊脂對倍稀釋法測定包括厄他培南、美羅培南和亞胺培南3種碳青霉烯類、頭孢菌素類、氟喹諾酮類和氨基糖苷類等16種抗生素對82株CRE菌株的 MIC,除了黏菌素和替加環(huán)素判斷標準按BSAC(Brifish Society for Antimicrobial Chemotherapy criteria,version9.1,March2010)外,其余MIC結果按

13、2010年更新版CLSI文件標準。以下研究的受試菌株均為82株CRE菌株。
　　藥敏試驗結果顯示,82株CRE菌株中68株耐碳青霉烯類抗生素的肺炎克雷伯菌對頭孢他啶,頭孢噻肟,頭孢吡肟,氨曲南以及厄他培南的耐藥率為100％;對兩種酶抑制劑復方制劑(頭孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他巴唑坦)的耐藥率均為95％左右;對亞胺培南和美羅培南的耐藥率為90％左右:對阿米卡星和環(huán)丙沙星的耐藥率分別為85.3％和97.1％。68株耐碳青霉烯類抗生素

14、的肺炎克雷伯菌中有70％的菌株對磷霉素和多西環(huán)素敏感;對黏菌素、米諾環(huán)素和替加環(huán)素的耐藥率相對較低;分別為2.9％,7.4％和13.2％。14株其他CRE菌株對環(huán)丙沙星和厄他培南全耐藥;對兩種酶抑制劑復方制劑以及頭孢他啶、頭孢噻肟、氨曲南的耐藥率均為92.3％;84.6％的菌株對頭孢吡肟和阿米卡星耐藥;對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為76.9％和61.5％;近70％的菌株對磷霉素耐藥:近60％的菌株對多西環(huán)素耐藥;對黏菌素、米諾環(huán)素和

15、替加環(huán)素耐藥率分別為15.4％,38.5％和23.1％。16種抗生素中,黏菌素和替加環(huán)素對82株CRE菌株的抗菌活性比較高,以2μg/mL和4μg/mL的濃度可以抑制90％的細菌。82株CRE菌株對碳青霉烯類和頭孢菌素類抗生素表現(xiàn)出高度耐藥水平,如亞胺培南、美羅培南、厄他培南對82株CRE菌株的MIC50/MIC90的值分別是32/64μg/mL,64/128μg/mL和128/256μg/mL。對碳青霉烯類抗生素全耐藥的細菌有68株,

16、其中60株為肺炎克雷伯菌。頭孢菌素類抗生素對82株CRE菌株的MIC90值均≧256μg/mL。本組受試的82株CRE均為多重耐藥株,其中泛耐藥菌株有54株(65.9％,54/82)。
　　此外,對68株碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌株的藥敏試驗結果顯示,碳青霉烯類抗生素聯(lián)合酶抑制劑克拉維酸或EDTA后,碳青霉烯類抗生素的抗菌活性幾乎沒有改變,但碳青霉烯類抗生素聯(lián)合3-氨基苯硼酸的抗菌活性有所提高,聯(lián)合3-氨基苯硼酸后的亞胺培南、美

17、羅培南、厄他培南對68株CRE肺炎克雷伯菌的MIC50/MIC90分別為1/1μg/mL,4/4μg/mL和8/8μg/mL,與單藥相比分別下降為單藥的1/32到1/64,特別是亞胺培南聯(lián)合3-氨基苯硼酸對細菌的作用特別強。碳青霉烯類抗生素聯(lián)合3-氨基苯硼酸后,對14株其他CRE菌株的抑菌作用也很明顯。碳青霉烯類抗生素聯(lián)合外排泵抑制劑MC207110對68株CRE肺炎克雷伯菌的體外抗菌活性無影響,而對14株其他CRE菌株的MIC50值顯

18、示有升高。
　　對68株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌的:PFGE分型,采用Quantity One圖像分析軟件,可分為18個型別。3個主要型別分別是J型(14株,20.6％)、N型(12株,17.6％)和R型(12株,17.6％)。其余如Q型6株,I型5株,D型4株,G、H和P型各有2株,A、B、C、E、F、K、L、M和O型各一株。MLST分型顯示,優(yōu)勢的克隆株為ST-11型,有57株(83.8％),其他的有ST-350型2株,ST

19、-16,ST-22,ST-23,ST-27,ST-107,ST-148,ST-477,ST-494和ST-544型別各一株。PFGE的3種主要型別均屬于ST-11型。
　　本組資料提示:
　　①碳青霉烯類耐藥株大多為泛耐藥株(65.9％,54/82)。
　?、陴ぞ睾吞婕迎h(huán)素具有體外抗CRE菌株的活性。
　　③碳青霉烯類聯(lián)合3-氨基苯硼酸對CRE菌株具有良好的抗菌活性:碳青霉烯類抗生素和外排泵抑制劑MC20711

20、0的聯(lián)合,未見碳青霉烯類抗生素對碳青霉烯類耐藥株的MICs降低。
　?、鼙窘M受試細菌存在3個主要克隆流行株,即J型(14株,20.6％)、N型(12株,17.6％)和R型(12株,17.6％)。ST-11為主要優(yōu)勢型別占83.8％(57/68)。PFGE分型中的主要型別J、N和R型都屬于ST-11。
　　第二部分CRE菌株中碳青霉烯酶及β-內酰胺酶基因型的分析
　　本研究采用改良Hodge試驗(MHT)和3-氨基苯硼酸

21、檢測法進行碳青霉烯酶表型的檢測。MHT對82株CRE的碳青霉烯酶的檢出菌株數為67株。以PCR方法為金標準,改良Hodge試驗對82株CRE的碳青霉烯酶的檢出敏感性和特異性分別是89.9％(62/69)和61.5％(8/13)。假陽性率和假陰性率分別為7.2％(5/69)和53.8％(7/13)。3-氨基苯硼酸抑制實驗檢測82株CRE中產碳青霉烯酶的菌株有70株,與PCR方法相比較,其靈敏度和特異性分別為92.7％(64/69)和53.

22、8％(7/13);假陽性率和假陰性率分別為8.8％(6/69)和38.5％(5/13)。改良Hodge試驗以及3-氨基苯硼酸2種方法對CRE腸桿菌科細菌中產碳青霉烯酶的檢出率分別與PCR方法相比較,并作統(tǒng)計學處理,顯示差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。EDTA協(xié)同碳青霉烯類抗生素檢測金屬酶結果顯示82株CRE菌株中未檢測到細菌產金屬酶。
　　目前,檢測KPC型碳青霉烯酶等耐藥基因的金標準仍是通過PCR擴增編碼KPC酶的耐藥基因并配

23、合DNA測序分析,以明確KPC酶的型別。我們采用PCR擴增技術對82株CRE菌株中的碳青霉烯酶基因進行擴增,并作DNA測序,結果顯示,在肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、弗勞地檸檬酸桿菌、產酸克雷伯菌、大腸埃希菌和產氣腸桿菌菌種中都檢出到產KPC酶的菌株。84.1％(69/82)的CRE菌株產生KPC型碳青霉烯酶酶,2株同時產OXA-69like型碳青霉烯酶。未檢測到產金屬β-內酰胺酶的菌株。
　　此外,采用PCR擴增技術對82株CRE菌

24、中包括ESBLs和質粒AmpC酶基因在內的β-內酰胺酶基因進行擴增和作DNA測序分析,結果顯示編碼ESBLs酶的基因在CRE細菌中普遍存在。其中產CTX-M型ESBLs酶的菌株有74株(90.2％):SHV-12型ESBLs酶有33株(40.2％),1株產SHV-31型ESBL。6株CRE細菌產質粒介導的AmpC酶,占7.3％(6/82),均為DHA-1型酶基因。產OXA-1、OXA-2和OXA-10等超廣譜酶的細菌各檢出1株:產TEM

25、-1廣譜酶的細菌占35.4％(29/82)。上述69株產KPC酶的CRE菌株中,僅1株細菌為單產KPC酶,其余67株合并產。ESBL,酶,另有1株合并產AmpC型酶。
　　為了解臨床分離的CRE細菌中編碼的KPC酶基因是否可在不同種屬的細菌間進行傳播,我們對4株同時產KPC-2酶和CTX-M型ESBL或DHA-1酶的CRE菌株(弗勞地檸檬酸桿菌和肺炎克雷伯菌各2株)進行了接合轉移試驗。受體菌為大腸埃希菌J53(對疊氮鈉耐藥)和EC

26、600(對利福平耐藥)。結果顯示,2株弗勞地檸檬酸桿菌分別將耐藥質粒轉移接合到了受體菌大腸埃希菌J53和EC600。KPC酶基因的PCR擴增和耐藥表型測定轉移接合子均和供體細菌一致。抽提供體菌CRE-3180和相應的大腸埃希菌J53的接合子中的質粒,對其進行了地高辛標記的檢測KPC基因的southern雜交試驗,結果顯示,轉移到接合子中的質粒攜帶KPC基因,質粒大小為23kb左右。而以EC600為受體菌的3株接合子中均檢測到3條質粒,經

27、過southern雜交試驗證實,3條質粒均帶有KPC基因。質粒大小不等,除一條為23kb左右外,其余兩條在23kb以上。
　　本研究采用PCR方法對I、II、Ⅲ類整合子在CRE菌中的分布及其攜帶的耐藥基因盒進行了分析,結果顯示68株CRE肺炎克雷伯菌株中I類整合子和Ⅱ類整合子的檢出率分別為55.9％(38/68)和4.4％(3/68)。其余14株CRE菌株的I類整合子和Ⅱ類整合子的檢出率分別為78.5％(11/14)和7.1％(1

28、/14)。未見Ⅲ類整合子檢出。I類整合子陽性的細菌中有91.8％(45/49)的菌株為產KPC酶株且同時合并產ESBl內酰胺酶,其中肺炎克雷伯菌占了73.4％(36/49)。Ⅱ類整合子陽性的細菌中產KPC酶的菌株有3株,且均為肺炎克雷伯菌。同時兼有兩類整合子檢出的細菌有2株,均為產KPC酶的肺炎克雷伯菌。PCR擴增整合子可變區(qū)的序列,可以得到3種大小不同的片段,分別約為250bp,750bp和1000bp。可變區(qū)序列用HinfⅠ酶切后得

29、到3組不同的片段。對PCR陽性結果的可變區(qū)序列進行測序,除了編碼氨基糖苷類鈍化酶基因aac(3)-I外,未發(fā)現(xiàn)其他耐藥基因盒。
　　本組資料結果提示:
　　①KPC-2型碳青霉烯酶是腸桿菌科細菌對碳青霉烯類耐藥的主要機制之一。
　?、贙PC-2基因可由質粒攜帶,并可在不同的細菌種屬間進行轉移播散。
　?、跧類整合子在本試驗菌株中檢出率高(59.7％,49/82)。
　?、芨牧糎odge試驗和3-氨基苯硼酸抑

30、制試驗檢測腸桿菌科細菌中碳青霉烯酶的靈敏度高;與PCR方法比較,上述兩種方法對CRE腸桿菌科細菌中碳青霉烯酶的檢出率差異無統(tǒng)計學意義。
　　第三部分碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌的外膜孔蛋白分析
　　采用外膜孔蛋白SDS-PAGE電泳對82株CRE菌株的外膜孔蛋白進行分析,結果顯示,22株CRE菌株存在OmpK35或其同源膜孔蛋白(如OmPC)的下調,其中17株為肺炎克雷伯菌;有22株存在OmpK35或其同源膜孔蛋白的缺失,其中

31、15株為肺炎克雷伯菌;OmpK35或其同源膜孔蛋白正常的為38株CRE,其中36株為肺炎克雷伯菌。10株CRE菌株存在OmpK36或其同源膜孔蛋白(如OmpF)的下調,其中5株為肺炎克雷伯菌;有57株存在OmpK36或其同源膜孔蛋白的缺失,其中48株為肺炎克雷伯菌;OmpK36或其同源膜孔蛋白正常的為15株CRE,全部為肺炎克雷伯菌。同時有OmpK35和OmpK36或其同源膜孔蛋白缺失的有12株,其中9株為肺炎克雷伯菌。65.8％(54

32、/82)的肺炎克雷伯菌株缺失OmpK35和OmpK36中的1條或者兩條都缺失,兩種膜孔蛋白表達都正常的有12株,全部為肺炎克雷伯菌。從膜孔蛋白角度看,OmpK36蛋白缺失的菌株占多數,肺炎克雷伯菌中有48株,14株其他CRE菌株中有9株。
　　本組試驗顯示細菌膜孔蛋白的缺失或下調表達也是腸桿菌科細菌對碳青霉烯類產生耐藥的機制之一。
　　第四部分產KPC酶的CRE菌株感染患者的臨床感染特征及危險因素
　　為了解CRE菌株

33、感染或定植患者的臨床感染特征及感染的危險因素,我們對本研究中68份保存完整的病史資料進行了回顧性的調查分析,同時以同期85份臨床分離的對碳青霉烯類抗生素敏感的菌株(CSE)檢出患者的病史資料作為對照,剔除或者不剔除定植菌株的患者資料,分析CRE和CSE菌株感染患者的臨床特征,然后剔除其他菌株,分析產KPC酶的肺炎克雷伯菌感染患者(非產KPC酶組分為兩種情況:CRE組非產KPC酶+CSE非產KPC酶株感染的患者、CSE非產KPC酶株感染的

34、患者)的潛在危險因素。結果顯示,CRE菌株感染患者的總住院天數平均值為49.55±36.91天,有56(96.6％)位患者為院內感染,2(3.4％)位患者為院外感染。住院期間有一次或以上手術者占37.9％(22/58)。有63.8％(37/58)的患者住院期間更換床位一次或以上,15.5％(9/58)的患者住院期間更換床位三次及以上。除2位患者沒有創(chuàng)傷性操作外,其余都有過創(chuàng)傷性的操作如氣管切開、深淺靜脈穿刺、腰穿和/或引流等。分別有94

35、.8％(55/58)、53.4％(31/58)的患者使用過導尿管和接受機械通氣:住院期間,抗菌藥物的使用情況如下:使用碳青霉烯類、喹諾酮類、氨基糖苷類、頭孢菌素類和其他類別抗生素(如四環(huán)素類、抗結核藥物、惡唑烷酮類、磷霉素類、抗真菌類和萬古霉素類等)的患者數分別占70.7％(41/58)、35.3％(24/58)、39.7％(23/58)、43.1％(25/58)和75.9％(44/58)。58位患者用于治療疾病的總費用平均值為4.08

36、x10(6)±1.74×10(5)元。除6位患者死亡,4位患者未愈之外,其余都有好轉或治愈。單因素分析CRE菌株感染患者的臨床特征,提示醫(yī)院感染、碳青霉烯類應用、侵襲性操作、手術、床位更換、氨基糖苷類應用、基礎疾病、神經外科和.ICU病房的差異是有統(tǒng)計學意義的。多因素分析醫(yī)院感染是CRE菌株感染患者的獨立危險因素。
　　單因素分析產KPC酶肺炎克雷伯菌感染的危險因素包括醫(yī)院感染、碳青霉烯類應用、侵襲性操作、神經外科和ICU病房。多

37、因素分析顯示,其中醫(yī)院感染、神經外科和ICU病房是產:KPC酶肺炎克雷伯菌感染的獨立危險因素。
　　本組資料提示:
　?、偬记嗝瓜╊惡皖^孢菌素類抗生素在臨床感染治療中使用頻繁;
　　②醫(yī)院感染是ERE菌株感染患者的獨立危險因素。醫(yī)院感染、神經外科和ICU病房是產KPC酶肺炎克雷伯菌感染的獨立危險因素;
　?、叟R床應加強CRE菌株的監(jiān)測并采取行之有效的醫(yī)院感染控制措施限制CRE菌株的進一步播散,例如對檢出CRE菌株