產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細菌耐藥表型和分子生物學(xué)特點的研究.pdf

1、目的：
　　研究臨床分離的碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌(CRE)的耐藥譜及耐藥機制，分析其流行傳播特點，為及時遏制臨床感染的暴發(fā)流行和抗菌藥物的合理使用提供指導(dǎo)。
　　方法：
　　1.收集溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院2012年1月-2013年11月間臨床連續(xù)分離的對碳青霉烯類藥物耐藥（耐藥+中介）的腸桿菌科細菌，分析其臨床分布特點及耐藥譜，了解該院耐藥菌株的耐藥形勢。
　　2.采用改良Hodge試驗對碳青霉烯類耐藥菌株

2、進行碳青霉烯酶表型確證試驗，初步篩查產(chǎn)碳青霉烯酶菌株;采用PCR技術(shù)擴增主要β-內(nèi)酰胺酶基因，包括碳青霉烯酶、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)和頭孢菌素酶（AmpC酶），并對陽性擴增產(chǎn)物進行測序和BLAST比對，檢測菌株耐藥基因的攜帶情況，研究菌株的耐藥機制。
　　3.利用碳青霉烯酶基因陽性菌株與受體菌J53和EC600的接合轉(zhuǎn)移試驗研究碳青霉烯酶基因及其質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移能力，對陽性接合子進行PCR驗證碳青霉烯酶基因及其它耐藥基因，

3、并檢測陽性接合子的體外藥敏情況。
　　4.通過脈沖場凝膠電泳(PFGE)與腸桿菌基因組間重復(fù)一致性序列(ERIC-PCR)分析我院產(chǎn)碳青霉烯酶菌株間的同源性，研究耐藥菌株的流行特征;通過多位點序列分型(MLST)，分析本研究中產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌與全球流行株的相關(guān)性。
　　5.提取產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的質(zhì)粒，利用普通PCR技術(shù)檢測碳青霉烯酶基因是否定位于質(zhì)粒上并分析其基因所在質(zhì)粒的大小。
　　結(jié)果：
　　1.本研

4、究共收集到溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院2012年1月-2013年11月臨床連續(xù)分離的非重復(fù)碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌57株，其中肺炎克雷伯菌25株，陰溝腸桿菌16株，產(chǎn)氣腸桿菌10株，產(chǎn)酸克雷伯菌2株，粘質(zhì)沙雷菌2株，摩根摩根菌1株，弗氏檸檬酸桿菌1株。菌株標(biāo)本來源以痰液為主，占63.2％，其次是血液(10.5％)、創(chuàng)口膿液(10.5％)、尿液(8.8％)和其它(7.O％)。菌株的科室來源較廣泛，但仍存在一定的聚集性，18株(31.6％)來

5、源于ICU病房，14株(24.6％)來源于神經(jīng)外科病區(qū)。臨床抗菌藥物體外敏感性試驗顯示，57株腸桿菌科細菌對碳青霉烯類有不同程度的耐藥，對亞胺培南和厄他培南的敏感率分別為21.1％和3.5％，同時對頭孢菌素類、單環(huán)內(nèi)酰胺類、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合物和呋喃妥因等抗菌藥物均表現(xiàn)出較高的耐藥性，敏感率基本都在20％以下，甚至全耐藥，但對氨基糖苷類（丁胺卡那、慶大霉素和妥布霉素）和氟喹諾酮類（左氧氟沙星）藥物的敏感性較好，尤其是丁胺卡那，敏感率

6、高達96.5％。
　　2.57株碳青霉烯類耐藥菌株中，改良Hodge試驗陽性的有37株(陽性率64.9％)，陰性20株;PCR檢測碳青霉烯酶基因陽性的37株（陽性率64.9％），陰性20株。以PCR擴增結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，改良Hodge試驗的靈敏度為97.3％，特異度為95％。57株腸桿菌科細菌耐藥基因測序結(jié)果顯示，27株攜帶KPC-2，6株攜帶NDM-1，3株攜帶IMP-4，1株攜帶IMP-8;42株攜帶ESBLs基因，陽性率73.

7、7％;16株攜帶AmpC酶基因，陽性率28.1％;大多菌株都同時攜帶多種耐藥基因，同時攜帶碳青霉烯酶基因及其它耐藥基因的占50.9％。
　　3.接合轉(zhuǎn)移試驗:27株產(chǎn)KPC-2菌株中，有24株獲得陽性接合子，3株未接合成功;4株產(chǎn)IMP菌株中有2株IMP-4和1株IMP-8接合成功，1株IMP-4未接合成功;6株產(chǎn)NDM-1的菌株全部接合成功。陽性接合子對β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥性很高，但對氨基糖苷類、氟喹諾酮類、復(fù)方新諾明和呋喃妥

8、因幾乎全部敏感。
　　4.脈沖場凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，10株產(chǎn)碳青霉烯酶的陰溝腸桿菌具有較高的同源性，存在五個不同的克隆型，其中主要克隆型A型有5株，均攜帶KPC-2，B型2株，均攜帶NDM-1，C、D、E型各1株，分別攜帶KPC-2、IMP-8和NDM-1。ERIC-PCR結(jié)果顯示，7株產(chǎn)氣腸桿菌具有很高的同源性，存在兩個不同克隆型，其中A型4株，B型3株，這7株菌均攜帶KPC-2碳青霉烯酶基因。同一克隆型菌株攜帶的耐藥基因相同（EA1

9、0除外），耐藥譜也基本相同，且來自同一病區(qū)。多位點序列分型顯示，17株碳青霉烯酶陽性的肺炎克雷伯菌中主要存在9個ST型，其中以ST11型為主，有6株，其次為ST13型4株，ST15、ST231、ST147、ST1、ST185和ST45各一株，另外，還發(fā)現(xiàn)一株新的ST型，提交肺炎克雷伯菌MLST數(shù)據(jù)庫，命名為ST1726。
　　5.經(jīng)質(zhì)粒PCR擴增結(jié)果顯示，所有碳青霉烯酶基因均存在于質(zhì)粒上，其中KPC-2均位于54 kb左右的質(zhì)粒，

10、IMP-4、IMP-8和NDM-1位于更大的約100 kb左右的質(zhì)粒上。
　　結(jié)論：
　　1.碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌(CRE)耐藥形勢非常嚴峻，多表現(xiàn)為多重耐藥，甚至對替加環(huán)素的敏感性也很差，但對氨基糖苷類和氟喹諾酮類藥物的敏感性較好，可替代β-內(nèi)酰胺類作為臨床感染的首選治療藥物。另外CRE菌株的科室來源具有一定的聚集性，提示臨床需加強這些病區(qū)的院感監(jiān)測和防控。
　　2.我院CRE菌株的耐藥機制主要是產(chǎn)碳青霉烯酶，

11、除了國內(nèi)外廣泛流行的KPC-2、IMP外，還檢測到了國內(nèi)少有報道的NDM-1金屬酶，且此種酶在多種腸桿菌科細菌中均有檢出;耐藥菌株大多同時攜帶多種耐藥基因，是導(dǎo)致菌株多重耐藥一個重要原因。本研究還證實了改良Hodge試驗對于快速篩查產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細菌具有很高的靈敏度和特異度。
　　3.大部分菌株可通過接合轉(zhuǎn)移試驗將碳青霉烯酶基因傳遞給受體菌大腸埃希菌，說明耐藥基因存在于可移動質(zhì)粒上，可通過水平傳播的方式引起耐藥菌株的流行播散