肺炎克雷伯臨床菌株基因組島的識別與鑒定.pdf

1、目前院內感染在臨床感染病人中所占的比例日益增高，已經引起人們越來越多的重視。院內感染多由耐藥的條件致病菌感染引起，抵抗力低下的病人如發(fā)生院內感染，將給治療帶來更大的困難。因此找到院內感染的傳播機制，從而有效控制院內感染是臨床治療的一個重要方面。條件致病菌對醫(yī)院抗生素壓力環(huán)境適應能力的增強以及臨床菌株中抗生素抗性基因的播散是導致院內感染傳播的重要原因。先前已有大量研究發(fā)現，一些抗生素抗性基因正在臨床條件致病菌中廣泛播散。而一些特殊的基因元

2、件可以在不同菌株之間水平轉移，在這些元件中可以攜帶有抗生素抗性基因，這些基因元件的轉移導致了抗性基因在菌株之間的傳播。目前研究較多的可轉移基因元件包括：接合性質粒、整合子、轉座子等。這些基因元件中大多攜帶有各種抗生素抗性基因，它們可以通過不同的分子機制在不同的菌株之間進行轉移，例如：接合性質粒通過接合作用，整合子通過att識別位點特異性重組，轉座子通過兩端攜帶的重復序列來達到重組的目的。這些基因元件的傳播在一定程度上導致了臨床耐藥菌株的

3、播散。
　　 另一方面，在臨床條件致病菌株感染過程中，抵抗抗生素抗性壓力只是其中的一個方面，除此之外，這些臨床菌株還需要適應各種各樣的生存環(huán)境壓力，包括溫度、pH、營養(yǎng)等等方面。而如何適應這些惡劣的環(huán)境，完成自身的生存，需要這些臨床菌株能夠快速的適應外界環(huán)境(包括抗生素抗性)多種方面的改變。近年來人們通過生物信息學分析發(fā)現在微生物的全基因組中，大部分的基因高度保守，稱為“基因骨架”，另外一部分基因則變異性很大，稱為“可變基因池”

4、，而這部分“可變基因池”主要是由于基因的水平轉移形成。近來有研究發(fā)現，一些大的基因片段可以在不同菌株之間水平移動，這些基因片段不同于接合性質粒、整合子或者轉座子，它們自身具有一些典型的結構特點：常位于tRNA基因位點后面；常攜帶有編碼整合酶或轉座酶的基因；GC含量與基因組的保守骨架不同；攜帶有一些重復序列；基因片段大小不等，大的可達100 kb以上等。這些片段攜帶的基因也是多種多樣的，可攜帶有與抗生素抗性相關的基因，也可攜帶有致病相關因

5、子或者代謝相關基因等等?，F在將具有以上特征的這些基因片段統(tǒng)稱為“基因組島(Genomic Island，GI)”?；蚪M島的水平轉移是形成“可變基因池”的主要來源之一，對于微生物在短時間內獲得新特性快速適應環(huán)境從而實現在短時間內的進化具有重要意義。
　　 目前基因組島已經在多種菌株中發(fā)現，研究較多的菌株包括Escherichiacoli、Salmonella enterica等。肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumon

6、iae)是臨床常見的條件致病菌之一，目前發(fā)現在肺炎克雷伯很多臨床菌株可以產生β-內酰氨酶，有的還攜帶有超廣譜β-內酰氨酶，導致對常用的β-內酰胺類抗生素耐藥。目前在K.pneumoniae菌株中也發(fā)現一個來源于耶爾森菌屬與致病相關的基因組島。但是是否在K.pneumoniae臨床菌株中存在著其它的基因組島對于K.pneumoniae臨床菌株的生存以及致病具有重要意義，目前還沒有相關研究，因此本課題的目的是挖掘K.pneumoniae臨床

7、耐藥菌株中的基因組島，探討K.pneumoniae臨床耐藥菌株播散的相關分子，為臨床K.pneumoniae臨床耐藥菌株播散的檢測以及控制提供一定的線索。
　　 由于基因組島大小不等，變異較大，因此很難找到一個簡單高效的篩選基因組島的方法。有人曾采用基因芯片的方法對基因組島進行篩選，但此方法費用較為昂貴，難以用于臨床菌株基因組島的普篩。由于基因組島的一個典型特征就是位于tRNA基因位點后面，歐竑宇等人采用生物信息學方法對肺炎克雷

8、伯菌株的tRNA基因位點進行分析，確定了一些可能為基因組島插入熱點的tRNA基因位點。同時進一步對這些位點的上下游保守序列進行分析，基于該位點上下游的保守序列設計特異性的引物對該位點進行篩選，根據PCR結果來確定是否有基因組島插入。
　　 (1)K.pneumoniae臨床耐藥菌株中基因組島的篩選針對生物信息學分析確定的基因組島可能的插入熱點進行PCR篩選，我們發(fā)現arg6 tRNA、asn34 tRNA、phe55 tRNA以

9、及met56 tRNA這四個基因位點確實是基因組島的插入熱點。我們發(fā)現51株臨床菌株在這四個位點上有83個位點上可能有基因組島的插入，其中arg6tRNA基因位點16個，ash34 tRNA基因位點9個，met56tRNA基因位點7個，而phe55 tRNA基因位點則全部沒有得到空位點長度的PCR產物。51株K.pneumoniae臨床菌株phe55 tRNA位點處有44株臨床菌株得到了3.7 kb的PCR擴增產物，我們將這個片段命名為

10、KpGI-1，1株臨床菌株(HS04160)得到了6.4 kb的PCR擴增產物，我們將這個片段命名為KpGI-2，6株臨床菌株沒有得到PCR擴增產物，懷疑有大的基因組島插入。在K.pneumoniae MGH78578基因組中，在這個位點有一個12.6 kb的基因組島插入，我們將它命名為KpGI-3?；蚪M島KpGI-3中攜帶了1個整合酶基因和7個鞭毛編碼相關基因。通過PCR篩選，我們發(fā)現菌株HS04053擴增得到了KpGI-3中7個鞭

11、毛編碼相關基因，但是沒有整合酶基因，而是一個更長的基因片段取代了這個整合酶基因。因此我們可以判斷在HS04053攜帶有一個變異了的KpGI-3基因組島。
　　 (2)KpGI-1和KpGI-2確定為新的基因組島我們將3.7 kb的PCR產物KpGI-1和6.4 kb的PCR產物KpGI-2進行測序，我們對KpGI-1和KpGI-2的基因序列分析發(fā)現，KpGI-1的GC含量為46.75％，KpGI-2的GC含量為38.03％，與K

12、.pneumoniae MGH78578基因組57.5％的GC含量存在明顯不同。同時KpGI-1和KpGI-2基因序列中，存在著163 bp的重復序列(DR)，這個163 bp的DR序列與K.pneumoniae MGH78578中的KpGI-3中的163 bp的DR序列完全一致。KpGI-1的orf2中攜帶有一個與轉座酶一致的保守的結構域(pfam01527)，KpGI-2的orf1中攜帶有一個不完整的整合酶基因(CAD06800)。

13、KpGI-1和KpGI-2的這些特點完全符合基因組島的特征，因此可以將KpGI-1和KpGI-2定義為兩個新的基因組島。
　　 通過對新基因組島KpGI-1和KpGI-2的DNA序列進行分析，KpGI-1中的orfs與目前已知的蛋白同源性均較低，但是有的基因中含有與已知基因一致的保守的結構域。KpGI-1中的orfs含有的結構域與乙?；D移酶的結構域(pfam00583)一致，KpGI-1中的orf4含有一個未知的結構域。與Kp

14、GI-1相似，KpGI-2中的大部分orfs與目前已知的蛋白同源性均較低，KpGI-2中的orf4含有結構域DEXDc(DEAD-like helicases superfamily)(CDD accession no.cd00046)和HELICc(Helicase superfamily c-terminal domain)(pfam00271)。KpGI-2中的ORF5與Salmonella enterica Weltevrede

15、n HI_N05-537菌株中的Fic蛋白具有高度同源性，并且ORF5同時含有Fic(filamentation induced by cAMP，Fic)蛋白家族的結構域(pfam02661)。
　　 (3)基因組島KpGI-2來源分析加基因最初在E.coil菌株中發(fā)現，被認為參與了cAMP誘導下細菌生長的調節(jié)。我們發(fā)現加基因不僅在E.coil菌屬中高度保守，同時在K.pneumoniae菌屬和S.enteria菌屬中也高度保守

16、。與E.coli菌屬和S.enteria菌屬不同的是，在臨床菌株來源的已測序菌株K.pneumoniae MGH78578基因組中含有兩個fic基因(kpn_03747和kpn_03553)。kpn_03747在K.pneumoniae菌屬中高度保守且與E.coil菌屬和S.enteria菌屬中的fic基因具有高度相似性，而另一個fic基因kpn_03553則與保守的加基因kpn_03747相似性較低。
　　 在51株K.pne

17、umoniae臨床菌株中，所有的菌株都含有基因kpn_03747，且與鄰近的基因也都具有高度的連鎖性。而51株K.pneumoniae臨床菌株中有3株失去了基因kpn_03553，其中一株為HS04160，失去了基因kpn_03553但攜帶有另一個fic基因，該加基因位于基因組島KpGI-2中。同時我們進一步分析發(fā)現KpGI-2中的加基因與Salmonella Weltevreden HI_05-537中的fic基因Sew_A3907具

18、有高度的相似性，而我們分析發(fā)現Sew_A3907也位于SalmonellaWeltevreden HI_N05-537菌株中phe tRNA.基因后的一個14.6kb的基因組島上。由此我們推測HS04160中的基因組島KpGI-2可能由S.enteria菌株中的基因Sew_A3907水平轉移而來。
　　 (4)KpGI-2基因組島的功能研究在E.coil K-12菌株中，cAMP可以誘導攜帶有fic基因的菌株發(fā)生絲化，并且使其生

19、長也受到抑制，而fic基因突變株和cAMP受體(CRP)突變株在cAMP誘導后則沒有細菌絲化現象以及生長抑制現象出現。因此，fic基因參與了cAMP對細菌絲化和生長的調節(jié)過程。我們將KpGI-2中攜帶的基因分別進行克隆，觀察這些基因以及KpGI-2在cAMP作用下對細菌形態(tài)和生長的影響，我們發(fā)現這些基因在cAMP作用下對細菌絲化的誘導為非特異性的，但是對細菌生長卻具有不同的作用?；騩rf2+orf3在cAMP作用下明顯抑制了細菌的生長