利用基因組重排技術(shù)選育土霉素高產(chǎn)菌株.pdf

1、土霉素(Oxytetracycline,OTC)是由龜裂鏈霉菌產(chǎn)生的一種堿性廣譜抗生素，作為強(qiáng)力霉素的原料藥在醫(yī)藥生產(chǎn)方面有廣闊的市場(chǎng)，作為獸用抗生素和飼料添加劑在畜牧業(yè)生產(chǎn)中有巨大的經(jīng)濟(jì)效益。本論文在對(duì)龜裂鏈霉菌(Streptomycesrimosus)菌株JH最佳原生質(zhì)體制備和再生條件的研究基礎(chǔ)上，運(yùn)用原生質(zhì)誘變技術(shù)篩選得到了3株土霉素產(chǎn)量較高和2株產(chǎn)孢能力較強(qiáng)的菌株，將其作為基因組重排的親本；通過(guò)最佳產(chǎn)孢培養(yǎng)基的篩選和基因組重排技

2、術(shù)選育土霉素高產(chǎn)菌株。
　　本文對(duì)龜裂鏈霉菌JH菌株原生質(zhì)體制備進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明JH菌株原生質(zhì)體制備的最佳條件為：250mL三角瓶中裝有50mL含2%甘氨酸的YEME培養(yǎng)基，5mL107個(gè)/mL孢子懸液接種，28℃、200r/min培養(yǎng)14h；4000r/min收集菌絲體，用10.3%蔗糖溶液清洗3次；用含2mg/mL溶菌酶的P溶液重懸菌絲體，37℃下脫壁90min，形成原生質(zhì)體數(shù)達(dá)5.5×107個(gè)/mL，原生質(zhì)體再生率27

3、.0%。
　　通過(guò)對(duì)龜裂鏈霉菌JH原生質(zhì)體進(jìn)行亞硝基胍(Nitrosoguanidine，NTG)誘變得到3株高產(chǎn)但產(chǎn)孢能力差的高產(chǎn)突變株3016、4016和4018，以及2株產(chǎn)孢能力較強(qiáng)的突變株1017和2016。對(duì)這3株高產(chǎn)突變株在燕麥培養(yǎng)基、麥麩培養(yǎng)基、鏈霉菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基、高氏培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基和種子固體培養(yǎng)基的產(chǎn)孢情況進(jìn)行對(duì)比，篩選出種子固體培養(yǎng)基是最佳產(chǎn)孢培養(yǎng)基。
　　30W紫外燈在30cm處照射35min或70℃水

4、浴處理60min均可使龜裂鏈霉菌原生質(zhì)體有效滅活。通過(guò)對(duì)促融劑PEG4000濃度和融合時(shí)間的優(yōu)化，得出龜裂鏈霉菌最佳原生質(zhì)體融合條件為：用40%PEG4000對(duì)原生質(zhì)體處理10min，融合率可達(dá)22%，并達(dá)到穩(wěn)定。在此基礎(chǔ)上，以NTG誘變篩選得到的3株高產(chǎn)突變株、2株產(chǎn)孢能力較強(qiáng)突變株和生長(zhǎng)周期最短的出發(fā)菌JH作為親本，進(jìn)行基因組重排育種。通過(guò)六輪基因組重排處理，以優(yōu)化的鏈霉素抗性平板進(jìn)行融合子的快速篩選、以瓊脂塊-酶標(biāo)儀法初篩、紫外分