基因組改組選育發(fā)酵木糖高產(chǎn)L-乳酸的米根霉菌株.pdf

1、近年來隨著糧食資源的日益緊張，開發(fā)利用可再生資源的呼聲日漸高漲，以木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)L-乳酸成為L-乳酸發(fā)酵研究的新熱點。木糖是半纖維素的主要組成單糖，在木質(zhì)纖維水解液中含量達到30％，僅次于葡萄糖位居第二，但野生米根霉菌株分解木糖產(chǎn)酸的能力較弱，選育高效利用木糖的米根霉菌株對木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-乳酸具有重要意義。本文采用基因組改組技術(shù)選育發(fā)酵木糖高產(chǎn)L-乳酸的米根霉菌株，研究改組菌株、突變株、原始菌株的發(fā)酵特性及相關(guān)酶活，采用

2、雙向電泳技術(shù)對各菌株進行比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析，初步探究改組菌株的性狀改良機制。主要結(jié)果如下：
　　(1)采用60Co-γ射線對米根霉As3.819進行誘變處理，根據(jù)菌株致死率、正突變率與輻射劑量的關(guān)系，確定出最佳輻射劑量為400Gy，在此條件下對菌株進行反復(fù)誘變，篩選出L-乳酸產(chǎn)量提高且遺傳穩(wěn)定性良好的突變菌株mut-33和mut-43，其L-乳酸產(chǎn)量分別為46.85g/L和45.75g/L，較原始菌株分別提高了18.1％和15.3

3、％。
　　(2)對米根霉原生質(zhì)體電融合條件進行了研究，選用0.6mol/L山梨醇作為滲透壓緩沖液，采用雙親滅活標(biāo)記篩選融合子，親本菌株mut-33的滅活條件為50℃加熱6min，mut-43的滅活條件為紫外照射180s。通過單因素試驗確定米根霉原生質(zhì)體的電融合參數(shù)為直流脈沖電壓260V，脈沖持續(xù)時間40μs，脈沖次數(shù)2次，融合率最高可達7.29％。
　　(3)以突變株mut-33和mut-43為親本，經(jīng)兩輪基因組改組篩選出性

4、狀優(yōu)良的改組菌株F2-17，108h后其L-乳酸產(chǎn)量達到58.12g/L，與同批發(fā)酵的原始菌株相比，其發(fā)酵周期縮短24h，L-乳酸產(chǎn)量提高44.87％，L-乳酸得率提高28.80％。對原始菌株As3.819、突變株mut-33、第一輪改組菌株F1-19、第二輪改組菌株F2-17利用木糖產(chǎn)酸時的XR、XDH、LDH酶活進行分析，結(jié)果表明：與原始菌株和親本菌株相比，改組菌株的XR、XDH、LDH酶活均有明顯的改善。
　　(4)確定了米

5、根霉菌體蛋白制備方法，可以獲得分辨率高、重復(fù)性好的雙向電泳圖譜。對原始菌株As3.819、突變株mut-33、改組菌株F1-19、F2-17的雙向電泳圖譜進行匹配分析，確定出21個差異蛋白點，質(zhì)譜鑒定出其中14個差異蛋白點。鑒定出的差異蛋白按照功能可以分為以下6類：①與丙酮酸胞質(zhì)代謝相關(guān)的酶；②與檸檬酸循環(huán)相關(guān)的酶；③與糖酵解相關(guān)的酶；④熱激蛋白；⑤細胞骨架蛋白；⑥與蛋白質(zhì)合成相關(guān)的蛋白。
　　(5)綜合各差異蛋白點在各菌株中的表