應(yīng)用基因組改組選育.pdf

1、對本實驗室自主篩選的琥珀酸產(chǎn)生菌ActinobacillussuccmogenesCGMCC1593進(jìn)行了鈉離子耐受性研究，將菌株分別進(jìn)行X—射線誘變、紫外線誘變和EMS化學(xué)誘變，篩選得到3株發(fā)酵性能有改良的菌株(X—8、UV-17及SE—6)，將其與實驗室保存的經(jīng)NTG誘變的高產(chǎn)菌株(SF—9)進(jìn)行基因組改組方法選育高產(chǎn)耐鈉菌株，獲得4株穩(wěn)定性較好的耐高濃度鈉離子高產(chǎn)突變株，并對其中一株(F3-10)進(jìn)行了初步發(fā)酵性能研究。

2、通過菌種特性研究，確定采用菌齡5h的菌體進(jìn)行誘變處理，并確定了篩選平板中NaCI臨界濃度為0.8mol/L；通過致死曲線的測定，確定了X—射線誘變照射時間40min，紫外誘變照射時間20s，EMS誘變處理濃度為2.0％，處理時間為20min。出發(fā)菌株分別經(jīng)X—射線誘變、紫外線誘變和EMS誘變，采用高濃度鈉離子平板進(jìn)行初篩，然后進(jìn)行厭氧瓶發(fā)酵HPLC復(fù)篩獲得3株鈉離子耐受性較好、琥珀酸產(chǎn)量較高的菌株X—8、UV-17及SE—6。

3、對菌種原生質(zhì)體制備及再生的影響因素進(jìn)行了考察，確定采用菌齡為5h的菌體，酶解時溶菌酶濃度為0.1mg/mL，37℃酶解30min，滲透壓穩(wěn)定劑為0.3mol/L的蔗糖，再生培養(yǎng)方式采用雙層平板再生。對原生質(zhì)體滅活標(biāo)記條件進(jìn)行了研究，確定紫外滅活5min，55℃熱滅活25min后原生質(zhì)體滅活率達(dá)100％。對原生質(zhì)體融合條件進(jìn)行了研究，確定融合條件為采用濃度為40％的PEG6000為助融劑，融合溫度為37℃，融合時間2min，此時融合率達(dá)2

4、.78×10-5。 采用多母本原生質(zhì)體遞近融合技術(shù)，經(jīng)過三輪改組后篩選得到4株穩(wěn)定性較好的高產(chǎn)突變株F3-2、F3-10、F3-13、F3-15，其中一株F3-10在厭氧瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵48h，琥珀酸積累39.7g/L，較原始菌株SW0580提高了36.0％，而在含0.2mol/LNaCl培養(yǎng)基中發(fā)酵時琥珀酸產(chǎn)量為30.3g/L，較原始菌株SW0580的17.6g/L提高了72.1％；以甘蔗糖蜜為原料在5L發(fā)酵罐中采用Na2C

5、O3控制發(fā)酵pH厭氧發(fā)酵48h，琥珀酸積累40.6g/L，較出發(fā)菌SW0580(26.8g/L)提高56.2％。F3-10菌株的耐鈉和發(fā)酵產(chǎn)酸性能較原菌株有明顯改善。 初步考察了突變株的發(fā)酵性能，在5L發(fā)酵罐中分別以甘蔗糖蜜、麥芽糖糖漿及葡萄糖為碳源進(jìn)行琥珀酸發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)利用甘蔗糖蜜作碳源時發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸效果最好；分別考察了酵母膏、玉米漿濃度對發(fā)酵罐中發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸的影響，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中不添加酵母膏時，琥珀酸產(chǎn)量明顯降低，增大培養(yǎng)基中玉