基因組改組選育泡菜中降解亞硝酸鹽能力增強(qiáng)乳酸菌菌株與特性分析.pdf

1、由于農(nóng)業(yè)中氮肥的大量使用，蔬菜中亞硝酸鹽殘留問(wèn)題頗受注目。亞硝酸鹽可引起消化道系統(tǒng)癌變以及血紅蛋白失去輸氧能力，引起機(jī)體缺氧中毒。生物法降解亞硝酸鹽具有高效性與無(wú)污染性而備受矚目，乳酸菌已被證實(shí)具有亞硝酸鹽降解能力，但是乳酸菌降解亞硝酸鹽機(jī)理尚未明確。論文利用基因組改組技術(shù)選育增強(qiáng)降解亞硝酸鹽能力的乳酸菌菌株，研究原始菌株、60Co-γ射線誘變菌株及基因組改組菌株的發(fā)酵特性并采用雙向電泳技術(shù)及蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定技術(shù)對(duì)各菌株進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)

2、分析與鑒定，對(duì)亞硝酸鹽降解機(jī)制進(jìn)行探究。主要結(jié)論如下：
　　(1)通過(guò)對(duì)分離所得乳酸菌與外購(gòu)菌株對(duì)亞硝酸鹽的耐受性、食鹽耐受性以及亞硝酸鹽降解能力比較分析選擇植物乳桿菌CICC20765為研究對(duì)象。采用60Co-γ射線對(duì)其進(jìn)行誘變處理，根據(jù)菌株致死率、正突變率與輻射劑量的關(guān)系，確定出合適的輻射劑量為800Gy。在此條件下對(duì)菌株進(jìn)行反復(fù)誘變，最終篩選出亞硝酸鹽降解率提高且遺傳穩(wěn)定性良好的突變菌株mut-1和mut-2，其亞硝酸鹽降解

3、率分別為53％和50％，并以mut-1和mut-2作為基因組改組的出發(fā)菌株。
　　(2)植物乳桿菌原生質(zhì)體制備及再生研究結(jié)果顯示，在15μg/mL變?nèi)芫亍?0mg/mL溶菌酶混合處理1h，此時(shí)原生質(zhì)體的形成率及再生率達(dá)到最高分別為94.5％和31％。
　　(3)制備的原生質(zhì)體在60℃熱滅活60min，紫外照射15s時(shí)致死率均達(dá)到100％。滅活的原生質(zhì)體在40％PEG6000溶液中室溫處理10min，此時(shí)原生質(zhì)體融合率最大。

4、
　　(4)以突變株mut-1和mut-2為親本，經(jīng)兩輪基因組改組篩選出性狀優(yōu)良的改組菌株F2-12，在MRS培養(yǎng)基中添加1.25g/L亞硝酸鈉，發(fā)酵培養(yǎng)24h，亞硝酸鹽降解率可達(dá)到86％，與原始菌株相比其降解亞硝酸鹽能力提高了1.04倍。
　　(5)對(duì)原始菌株、誘變菌株及改組菌株的發(fā)酵特性研究結(jié)果表明，與原始菌株相比，改組菌株的亞硝酸鹽還原酶最大酶活提高了2.64倍，葡萄糖的消耗速率與乳酸產(chǎn)量也有一定的提高。制作甘藍(lán)泡菜并

5、接種純種乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中，接種改組菌株發(fā)酵組亞硝酸速率比自然發(fā)酵組、原始菌株組、誘變菌株組要快并且“亞硝峰”峰值低于其它三組。
　　(6)確定了構(gòu)建分辨率高、重復(fù)性好的雙向電泳圖譜的蛋白質(zhì)提取方法以及合適的pH范圍的預(yù)制膠條。對(duì)植物乳桿菌原始菌株CICC20765、突變株mut-1、改組菌株F2-12的雙向電泳圖譜進(jìn)行匹配分析，確定出19個(gè)差異蛋白點(diǎn)，質(zhì)譜鑒定出其中14個(gè)差異點(diǎn)的蛋白。
　　(7)對(duì)各個(gè)差異蛋白表達(dá)點(diǎn)的表達(dá)量