井岡霉素高產的比較功能基因組研究.pdf

1、井岡霉素是我國自主開發(fā)、應用面積最廣、產業(yè)化最為成功的農用抗生素之一，主要用于防治水稻紋枯病，同時也是糖尿病治療藥物伏格列波糖合成的重要前體，具有較高的產品附加值。井岡霉素產生菌吸水鏈霉菌井岡變種是上世紀70年代由沈寅初院士從井岡山地區(qū)分離到的，其正常生長溫度為30℃，但在發(fā)酵溫度為37℃時，產量有大幅度提高。在搖瓶發(fā)酵條件下，實驗室菌株5008的產量約為2克/升，經過四十年的傳統(tǒng)誘變育種，其衍生的工業(yè)菌株TL01產量達到18克/升，在

2、工廠發(fā)酵罐中甚至高達30克/升，發(fā)酵周期僅為2天。因此，該類菌株具有產量高、發(fā)酵溫度高和發(fā)酵周期短等優(yōu)良特性，這為通過比較功能基因組學研究揭示井岡霉素的高產機制提供了極佳的研究材料。本論文主要分為以下四個部分。
　　第一部分，井岡霉素產生菌5008基因組完整圖譜的構建與解析
　　利用454測序技術測定了菌株5008的基因組序列，使用各種文庫（6-8 kb質粒文庫和fosmid文庫）末端序列信息、數(shù)據(jù)分析與基本分子生物學實驗進

3、行了草圖中缺口的填補，并結合特殊的末端片段克隆方法識別了5008基因組的四個端粒，成功構建了5008基因組的完整圖譜。除了大小為10,145,833 bp線型染色體外，通過脈沖場電泳還發(fā)現(xiàn)了164,566 bp的線型質粒，同時結合大質粒提取和電泳分析還確認了73,285 bp的環(huán)型質粒。
　　鏈霉菌基因組的比較分析發(fā)現(xiàn)，5008染色體有著相對較小的核心區(qū)（5.56 Mb）、最短的末端反向重復序列（14 bp），并編碼了更多（比例）

4、的α/β水解酶、MFS轉運蛋白和鎂離子/錳離子依賴的磷酸酶。還編碼了29個聚酮（PKS）、非核糖體肽類（NRPS）、雜合聚酮-多肽（PKS-NRPS）、萜類（terpene）、硫肽類（lantibiotic）等次級代謝產物，其中只有井岡霉素和環(huán)噻唑霉素合成基因簇得到確認。另外，我們重建了井岡霉素合成前體相關的初級代謝通路，碳源前體為7-磷酸景天庚酮糖和UDP-葡萄糖，氮源前體可能為谷氨酸。分析發(fā)現(xiàn)5008存在兩個UDP-葡萄糖合成酶的編

5、碼基因（ugp），用于提供糖基合成井岡霉素，而其它已測序的鏈霉菌只編碼一個ugp。
　　第二部分，井岡霉素生物合成溫度調控的轉錄組研究
　　通過基因組芯片技術，我們分析了5008在30℃與37℃條件下的轉錄譜變化，在37℃分別有701個上調和841個下調的差異表達基因。鑒于阿維鏈霉菌NRRL8165與5008有著更多的同源基因，且不存在抗生素合成的溫度調控現(xiàn)象，我們開展了在同樣發(fā)酵條件下的NRRL8165轉錄組分析，在37℃

6、下分別有422個上調和611個下調的差異轉錄基因。除去共同的差異表達基因并在更嚴謹參數(shù)的篩選下，5008分別有122個上調和237個下調的顯著差異表達基因，其中氨基酸轉運和代謝、無機離子轉運和代謝中具有更多的顯著下調基因。
　　在次級代謝中，除了糖基轉移酶 ValG、轉運蛋白 ValH和雙組份調控蛋白ValPQ外，井岡霉素基因簇中其它基因的轉錄水平有著4-23倍的顯著上調，另外還發(fā)現(xiàn)有3個次生代謝合成基因簇的整體轉錄水平發(fā)生顯著上

7、調。在初級代謝中，第一，糖酵解中6-磷酸果糖激酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶和丙酮酸激酶基因的轉錄水平略有下調，同時葡萄糖酸激酶和檸檬酸裂解酶顯著上調，這暗示37℃發(fā)酵條件下糖酵解和三羧酸循環(huán)的代謝速率降低，碳代謝流量發(fā)生改變并更多地進入到磷酸戊糖途徑。第二，一些關鍵氮代謝基因，如谷氨酰胺合成酶GlnA和氮代謝調控蛋白GlnR，在37℃是顯著下調的，而催化2-酮戊二酸生成谷氨酸的谷氨酸脫氫酶是上調的，這暗示5008在37℃時處在高濃度谷氨酸環(huán)

8、境下。進一步利用氨基酸分析儀發(fā)現(xiàn)5008胞內谷氨酸濃度在37℃時僅有30℃的十分之一，而谷氨酰胺的濃度較為接近，這暗示谷氨酸作為氮代謝前體在37℃條件下主要用于合成井岡霉素。
　　在22個顯著差異轉錄的調節(jié)基因中，一個SARP家族轉錄調節(jié)基因SHJG0322的轉錄展現(xiàn)出最高的溫度敏感性（128倍）。該基因缺失突變株JG27在30℃條件下井岡霉素產量接近于菌株5008，而在37℃條件下其產量不到5008的20％。轉錄分析結果顯示va

9、lA和valK在37℃分別上調了100倍和26倍，而在JG27中都只上調了6倍。分別使用紅霉素抗性基因強啟動子和天然啟動子控制下的SHJG0322對JG27進行回補，發(fā)現(xiàn)回補菌株在37℃條件下產量都上升到5008的80%以上。這表明SHJG0322作為正調節(jié)基因參與了井岡霉素合成的溫度調控。
　　第三部分基于比較組學的井岡霉素高產機制解析
　　我們進一步測定了工業(yè)菌株TL01的基因組序列，其染色體大小為9.84 Mb，比菌株

10、5008小305.76 kb。主要差別在于靠近染色體左臂的三個大片段的缺失，大小分別為78.98 kb、144.01 kb和79.63 kb，共編碼了234個蛋白，其中有61個轉座酶、18個調控蛋白、16個轉運蛋白、28個水解酶和56個未知功能蛋白。我們在5008中分別敲除了這三個區(qū)域，其產量從4.7克/升分別提高到7.5克/升、7.6克/升和13.9克/升。在同時缺失三個區(qū)域的多重突變株中，產量繼續(xù)提高到14.9克/升，接近工業(yè)菌株產

11、量的80%以上。
　　另外，兩個基因組中還存在33個InDel和90個SNV位點，除了在井岡霉素結構基因間隔區(qū)，還位于78個已知功能基因（編碼了18個轉錄因子、39個初級代謝相關酶和8個轉運/膜蛋白等）和24個未知功能基因的內部或上游區(qū)域。第一，在工業(yè)菌株井岡霉素基因簇中，反向排布的valABC與valKLMN操縱子之間存在137 bp缺失；第二，對其中的7個調節(jié)基因進行敲除，突變株產量都有不同程度的提高（5.6-13.3 g/L

12、），表明發(fā)生遺傳變異的調節(jié)基因降低了對井岡霉素合成的嚴謹調控作用；第三，初級代謝中關鍵酶（檸檬酸合成酶、尿黑酸雙加氧酶和乙酰/丙酰-CoA羧化酶）發(fā)生遺傳突變降低了三羧酸循環(huán)的代謝速率，使得工業(yè)菌株代謝流量發(fā)生變化。
　　井岡霉素高產是其產生菌基因組和外界發(fā)酵環(huán)境相互作用的結果，除了研究5008在30℃和37℃條件下的轉錄譜變化，我們還開展了5008和TL01分別在低產普通發(fā)酵培養(yǎng)基（YMG）和高產工業(yè)培養(yǎng)基（IND）中的轉錄組分

13、析。TL01相比5008在YMG和IND條件下分別有942個和1772個差異表達基因（DEGs）。然而相比YMG，5008和TL01在IND條件下的DEGs分別達到5314個和4761個，顯示出不同培養(yǎng)基對基因表達的巨大擾動。
　　不考慮培養(yǎng)基變化，TL01相比5008有282個共同的DEGs，其中僅有萜類和環(huán)噻唑霉素基因簇的轉錄顯著上調。而在糖異生途徑中兩個關鍵酶果糖1,6-二磷酸和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶平均分別上調5.1倍和16

14、.8倍。另外，共同下調的131個DEGs中絕大多數(shù)由三個缺失區(qū)域與線型質粒編碼。有趣的是，相比5008，TL01僅在IND條件下出現(xiàn)染色體區(qū)域性的轉錄譜變化，即在染色體左末端到大片段缺失區(qū)域III這一段接近1.9 Mb的區(qū)域內，只有井岡霉素和PKS-II型的基因簇是轉錄上調，其余都是轉錄下調的，線型質粒編碼基因顯著下調，同時脈沖場電泳發(fā)現(xiàn)線型質粒在 TL01中有著更低拷貝。不考慮菌株變化，相比YMG培養(yǎng)環(huán)境，在IND條件下有3749個共

15、同的DEGs，其中井岡霉素合成基因的轉錄顯著上調，平均提高超過100倍。另外，我們還發(fā)現(xiàn)線型質粒和環(huán)型質?；蛟贗ND條件下都是顯著上調的。
　　因此，菌株（遺傳）變化可選擇性地調節(jié)基因組的轉錄，使得一些消耗能量的區(qū)域（如線型質粒和一些染色體非必需區(qū)域）轉錄顯著下調，同時少量初級代謝基因轉錄發(fā)生顯著變化使其代謝流發(fā)生轉向，有利于井岡霉素的合成。而培養(yǎng)基（環(huán)境）改變對菌株影響更大，相應地帶來更多能量，除了顯著誘導激活井岡霉素合成基因

16、外，還可以保證其內源質粒進行高效復制。
　　第四部分組學分析基礎上的井岡霉素工業(yè)菌株的正向工程改造
　　基于以上組學分析，我們考慮初步從系統(tǒng)的水平改造工業(yè)菌株 TL01。一方面利用Cre-LoxP的特異性重組系統(tǒng)對在 TL01中整體轉錄下調的大片段區(qū)域進行了缺失，突變株產量沒有顯著提高，但生長較為迅速，積累了更多生物量，表明該菌株代謝更為旺盛。另一方面，通過高溫與超低濃度的SDS聯(lián)用方法將線型質粒進行消除。首先對菌株5008

17、進行線型質粒消除，得到的兩個突變株產量都有明顯增加，分別提高了48.6%與37.2%。隨后，進一步對工業(yè)菌株TL01進行線型質粒消除，其產量從18.4克/升提升到突變株的22.2克/升，提高了20%以上。
　　綜上所述，本論文通過比較基因組、轉錄組分析并結合經典的遺傳操作成功揭示了井岡霉素高產的分子機理，在此基礎上定向改造現(xiàn)有工業(yè)菌株，初步實現(xiàn)了超高產工程菌的構建，為進一步理性改良井岡霉素產生菌與優(yōu)化其生產工藝奠定了理論基礎，同時