井岡霉素生物合成限速步驟解析及高產(chǎn).pdf

1、井岡霉素作為抗水稻紋枯病的重要農(nóng)用抗生素,在中國等亞洲國家被廣泛使用,是我國的科研人員開發(fā)的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的安全、高效、低價的抗真菌農(nóng)藥。由于其諸多優(yōu)點(diǎn),被迅速推廣。目前我國對井岡霉素需求已經(jīng)超過6萬噸,年產(chǎn)值超4億元。因此深入研究井岡霉素發(fā)酵過程及其產(chǎn)生菌的基因表達(dá)與代謝具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和社會效益。
　　 在井岡霉素的發(fā)酵過程中,作為井岡霉素生物合成前體的有效氧胺有較大量的積累。這種積累對于工業(yè)生產(chǎn)井岡霉素的發(fā)酵過程而言,

2、是不經(jīng)濟(jì)的。如果能夠消除這種前體物的積累,將可能提高發(fā)酵終產(chǎn)物井岡霉素的產(chǎn)量。
　　 我們首先系統(tǒng)分析了有效氧胺積累的原因。造成有效氧胺積累的可能原因有兩類:一是菌體將已經(jīng)合成的井岡霉素再次分解生成有效氧胺,即在菌體中存在有效氧胺完全轉(zhuǎn)化生成井岡霉素,再分解形成有效氧胺的過程(有效氧胺一井岡霉素一有效氧胺)。這可能是由于井岡霉素的β-糖苷鍵不穩(wěn)定,在發(fā)酵過程中分解。針對于這種可能性,我們設(shè)計了將井岡霉素添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中,在不接

3、種的情況下在發(fā)酵溫度(37℃)下連續(xù)培養(yǎng)一個發(fā)酵周期(5天),檢測發(fā)現(xiàn)沒有有效氧胺的生成,表明井岡霉素在發(fā)酵過程中是穩(wěn)定的,不會被分解生成有效氧胺。這種積累也可能由于菌體在發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)生水解井岡霉素生成有效氧胺的β-糖苷酶。我們將井岡霉素分別添加到井岡霉素生物合成基因valA缺失突變株JXH1的胞外蛋白體系和cell-free體系中,同樣也未檢測到井岡霉素的分解和有效氧胺的產(chǎn)生,因此這種積累也不是由于菌體所產(chǎn)生的β-糖苷酶的酶解所造

4、成的。
　　 有效氧胺積累的第二類可能原因是由于糖基化不完全造成的。糖基化過程受到糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活力和糖基供體的供給的影響。我們將糖基轉(zhuǎn)移酶基因陽valG分別克隆到紅霉素啟動子PermE*井岡霉素生物合成基因valA的啟動子PvalA的下游,并通過整合型載體pPM927將糖基轉(zhuǎn)移酶基因valG在井岡霉素高產(chǎn)菌株中進(jìn)行超量表達(dá)。轉(zhuǎn)錄分析表明valG基因在PvalA啟動子的控制下,其轉(zhuǎn)錄水平在發(fā)酵前期(24小時)及發(fā)酵中期(48小

5、時)提高到2.5倍以上,而在發(fā)酵后期(120小時),則仍保持在1.7倍以上。而在紅霉素啟動子PermE*啪控制下,valG的轉(zhuǎn)錄水平則始終保持在1.1-1.3倍。這表明使用此超量表達(dá)系統(tǒng),糖基轉(zhuǎn)移酶valG基因的轉(zhuǎn)錄水平有一定的提升。同時我們還發(fā)現(xiàn)在井岡霉素產(chǎn)生菌中,井岡霉素生物合成基因valA的啟動子PvalA的作用優(yōu)于紅霉素啟動子PermE*。對ValG的酶活驗證表明,使用PvalA超量表達(dá)valG基因,糖基轉(zhuǎn)移酶活力由234 pk

6、at/毫克總蛋白提高到460 pkat/毫克總蛋白,酶活力提高了近一倍。但通過對井岡霉素的產(chǎn)量和井岡霉素與有效氧胺的比例的檢測,我們發(fā)現(xiàn)超量表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶ValG沒有能夠減少有效氧胺的積累,同時井岡霉素的產(chǎn)量也沒有明顯的增加。證明糖基轉(zhuǎn)移酶的酶活不足不是有效氧胺積累的原因。
　　 糖基化的過程,除了受到糖基轉(zhuǎn)移酶活力的影響外,還與糖基供體的供給有關(guān)。因此我們進(jìn)一步分析糖基供體UDP-葡萄糖的供給對于糖基化過程的影響。當(dāng)我們添加U

7、DP-葡萄糖至井岡霉素產(chǎn)生菌TL01小量發(fā)酵液中以及cel1-free體系中時,檢測結(jié)果表明糖基化過程均被顯著地加強(qiáng)。在含有大量UDP-葡萄糖存在的體系中,幾乎未見有效氧胺的積累,此實(shí)驗充分說明了井岡霉素產(chǎn)生菌中UDP-葡萄糖的供給不足可能是造成有效氧胺積累的原因。
　　 我們繼而分析了井岡霉素產(chǎn)生菌中的UDP-葡萄糖的合成過程,并對參與UDP-葡萄糖合成過程的6-磷酸葡萄糖激酶(4779.Opkat/毫克總蛋白)、6-磷酸葡萄

8、糖變位酶(1763.4pkat/毫克總蛋白)以及UDP-葡萄糖焦磷酸酶(26.4pkat/毫克總蛋白)之間酶催化活力進(jìn)行了測定和比較。結(jié)果表明,相對于參與UDP-葡萄糖合成的其它酶的活力,UDP-葡萄糖焦磷酸酶的催化活力明顯較低,其催化活力同時遠(yuǎn)低于次級代謝過程中的糖基轉(zhuǎn)移酶的活力(234 pkat/毫克總蛋白)。通過以上實(shí)驗,我們基本確定了井岡霉素產(chǎn)生菌中UDP-葡萄糖焦磷酸酶的活力不足是造成有效氧胺積累的主要原因。我們繼而通過超量表

9、達(dá)UDP-葡萄糖焦磷酸酶以提高菌體內(nèi)UDP-葡萄糖的供給。
　　 我們在吸水鏈霉菌井岡變種5008中成功克隆到了UDP-葡萄糖焦磷酸酶合成基因(ugp),并對其體外催化活力進(jìn)行了驗證。將此基因克隆到PvalA啟動子的下游,并通過整合型載體將ugp導(dǎo)入TL01中。對基因工程菌株的基因轉(zhuǎn)錄和體外酶活的測定表明ugp在轉(zhuǎn)錄水平上提高了2.5倍,而UDP-葡萄糖焦磷酸酶酶活力則從26.4pkat/毫克總蛋白提高到54.2pkat/毫克總

10、蛋白,從而確定了ugp在TL01中的超量表達(dá)。進(jìn)一步的產(chǎn)量檢測顯示通過超量表達(dá)UDP-葡萄糖焦磷酸酶,井岡霉素高產(chǎn)菌株TL01的產(chǎn)量從18克/升提高到了22克/升。并且井岡霉素與有效氧胺的比例(mol/mol)從3.15提高到了5.75,有效氧胺積累量顯著下降。
　　 因此,我們通過系統(tǒng)分析和實(shí)驗證明,通過超量表達(dá)UDP-葡萄糖焦磷酸酶的方式增加糖基供體UDP-葡萄糖的供給,能夠顯著地減少糖基配體有效氧胺的積累,并且能夠有效的提

11、高井岡霉素的產(chǎn)量。
　　 此外,我們還建立了井岡霉素高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法。井岡霉素及其生物合成前體有效氧胺是海藻糖酶的抑制劑,其中有效氧胺的體外抑制活性是井岡霉素的100倍以上。我們通過體外添加抑制劑的方法,檢測海藻糖酶水解生成葡萄糖反應(yīng)的抑制程度,并利用在一定濃度范圍內(nèi)抑制劑濃度與生成葡萄糖濃度之間的線性關(guān)系,間接測量所添加的抑制劑的濃度。但由于有效氧胺和井岡霉素以一定的比例存在于發(fā)酵產(chǎn)物中,因此對于后續(xù)的高通量篩選而言,

12、少量的有效氧胺所帶來的抑制活性可能會超過大量的井岡霉素的抑制活性。因此,本實(shí)驗采用突變井岡霉素生物合成基因簇中的糖基轉(zhuǎn)移酶的策略,使得發(fā)酵產(chǎn)物中只存在有效氧胺。以高產(chǎn)菌株糖基轉(zhuǎn)移酶突變菌株XZ2為出發(fā)菌株,通過全基因組轉(zhuǎn)座子突變的方法,篩選顯著影響有效氧胺產(chǎn)量的突變株。在研究過程中我們分別建立了利用顏色反應(yīng)高通量的篩選突變株的方法、高通量的培養(yǎng)鏈霉菌的方法,同時優(yōu)化了鏈霉菌體內(nèi)轉(zhuǎn)座系統(tǒng)。
　　 1.高通量的篩選有效氧胺突變株的方

13、法
　　 對于高通量的篩選過程,我們利用了前述的有效氧胺在體外抑制海藻糖酶的原理。首先對水解反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化,通過100倍稀釋微孔培養(yǎng)體系中有效氧胺的發(fā)酵提取液,使得海藻糖水解反應(yīng)在加入一定濃度范圍內(nèi)(1-10 mg/L)的有效氧胺發(fā)酵提取液后,所生成的葡萄糖的濃度能夠在20μg/ml至80μg/ml的濃度范圍內(nèi)。在此線性范圍內(nèi),即可利用顏色的深淺來反映有效氧胺對于此水解反應(yīng)的抑制程度。顏色越深,所生成的葡萄糖越多,反應(yīng)體系中

14、的有效氧胺的量越低。顏色越淺,所生成的葡萄糖越少,反應(yīng)體系中的有效氧胺的量越高。此顏色反應(yīng)可通過酶標(biāo)儀進(jìn)行高通量的檢測。
　　 2.高通量的培養(yǎng)鏈霉菌的方法
　　 由于需要培養(yǎng)大量的突變株以驗證其產(chǎn)量的差異,故傳統(tǒng)的搖瓶發(fā)酵策略無法滿足實(shí)驗的需要。我們設(shè)計使用1ml深孔96孔板對大量的突變體進(jìn)行固體培養(yǎng)發(fā)酵,有效地縮小了培養(yǎng)體系的體積。400μL的固體培養(yǎng)基添加至1mL的微孔中至培養(yǎng)結(jié)束后將培養(yǎng)基碾碎。添加400μL的無

15、菌水至每個孔中作為提取液。將96孔板使用密封條密封后,置入超聲波清洗器中超聲提取30分鐘。再置于37℃,220轉(zhuǎn)搖床中提取6個小時。經(jīng)此提取步驟后,有效氧胺的殘留量低于首次提取量的5％。對微孔固體發(fā)酵的發(fā)酵曲線進(jìn)行測定,最終確定了8天的培養(yǎng)周期。此培養(yǎng)體系具有良好的平行性和重復(fù)性,8株平行株的產(chǎn)量誤差在5%以內(nèi),能夠滿足后續(xù)實(shí)驗所需的高通量篩選的要求。
　　 3.鏈霉菌體內(nèi)轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的優(yōu)化。
　　 我們使用了能夠在天藍(lán)色鏈

16、霉菌中高效轉(zhuǎn)座的pTNM,此質(zhì)粒上攜帶有Tn5轉(zhuǎn)座系統(tǒng)以及溫敏型復(fù)制子,能夠通過提高培養(yǎng)溫度使質(zhì)粒丟失。但由于以溫敏型復(fù)制子pSG5衍生的質(zhì)粒在井岡霉素產(chǎn)生菌中以高溫(超過42℃)培養(yǎng)依然難以完全丟失,因此我們構(gòu)建了由pIJ101衍生的轉(zhuǎn)座質(zhì)粒。含有新轉(zhuǎn)座質(zhì)粒的井岡霉素產(chǎn)生菌在沒有抗生素添加的情況下培養(yǎng),質(zhì)粒將會由于沒有選擇壓力而完全丟失。通過硫鏈絲菌素的誘導(dǎo)并松弛培養(yǎng),能夠得到大量隨機(jī)的插入突變體,轉(zhuǎn)座發(fā)生的頻率在103-104之間。

17、對14株突變株的總DNA使用BamHI進(jìn)行酶切處理,其中含有轉(zhuǎn)座子元件的片段,通過酶聯(lián)反應(yīng)后能夠形成具有特殊復(fù)制子的環(huán)形DNA。通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌并使用轉(zhuǎn)座子元件內(nèi)部的引物進(jìn)行測序反應(yīng),能夠?qū)Σ迦胛稽c(diǎn)進(jìn)行定位。使用此方法得到了14個不同的插入位點(diǎn),表明插入位點(diǎn)具有很好的隨機(jī)性。
　　 本研究共對836株有效氧胺的突變株進(jìn)行了高通量的篩選,并對于此篩選體系進(jìn)行了評估。其中有8株突變株,其有效氧胺的產(chǎn)量較出發(fā)菌株存在明顯的變化(±＞2