碳霉素與必特螺旋霉素生物合成調(diào)控的研究.pdf

1、必特螺旋霉素(Bitespiramycin，BT)是將耐熱鏈霉菌（Streptomycesthermotolerans）的4"-O-異戊酰基轉(zhuǎn)移酶基因(4"-O-isovaleryltransferase gene，ist)整合至螺旋霉素產(chǎn)生菌S.spiramyceticus F21基因組所獲得的基因工程菌產(chǎn)生的，主成分為4"-O-異戊酰螺旋霉素(4"-O-isovalerylspiramycin，ISP)。ist基因表達(dá)水平的提高可提

2、高必特螺旋霉素中ISP的比例，從而簡化其生產(chǎn)工藝，降低生產(chǎn)成本。本文對ist的特異性調(diào)控基因進(jìn)行研究，為提高ist基因的表達(dá)水平提供了重要依據(jù)。
　　有研究推測acyB2基因可能是ist的正調(diào)控基因，但未從基因功能上予以證實。本研究將耐熱鏈霉菌中的acyB2基因失活后，突變菌株無法合成碳霉素，acyB2的回復(fù)可以使碳霉素重新產(chǎn)生，利用鏈霉菌強啟動子ermE*p過表達(dá)acyB2基因能夠大幅度提高碳霉素的產(chǎn)量。結(jié)果證實acyB2是碳霉

3、素生物合成的正調(diào)控基因。本研究還在耐熱鏈霉菌中克隆到一個與acyB2基因連鎖的新調(diào)控基因cbmR。阻斷cbmR基因也導(dǎo)致菌株無法合成碳霉素，回復(fù)cbmR基因可以恢復(fù)碳霉素的產(chǎn)生。但是利用強啟動子ermE*p過表達(dá)cbmR，碳霉素的合成反而受到了抑制。通過qPCR在野生菌株、acyB2阻斷菌株和cbmR阻斷菌株中檢測了碳霉素生物合成基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示AcyB2和CbmR可激活碳霉素生物合成基因簇中多數(shù)基因的轉(zhuǎn)錄，包括ist基因。在a

4、cyB2過表達(dá)菌株中，被調(diào)控的靶基因也過表達(dá)，而cbmR過表達(dá)菌株中靶基因的表達(dá)反而被抑制，這與碳霉素合成的結(jié)果一致。為了研究cbmR和acyB2的調(diào)控機制，通過優(yōu)化表達(dá)條件，獲得CbmR和AcyB2蛋白在E.coli BL21(DE3)/pKJE7中的可溶性表達(dá)。
　　螺旋霉素生物合成基因簇中含有與acyB2和cbmR同源的兩個調(diào)控基因srm40和srm22，srm40是螺旋霉素生物合成的途徑特異性正調(diào)控基因，srm22又正調(diào)控

5、srm40的表達(dá)。在麥迪霉素生物合成基因簇中也有同源的兩個正調(diào)節(jié)基因orf27和orf28，orf28正調(diào)控orf27。碳霉素、螺旋霉素和麥迪霉素屬于結(jié)構(gòu)相似的16元大環(huán)內(nèi)脂，生物合成基因在進(jìn)化上也存在相似性，同源的正調(diào)控基因功能很可能相似，能進(jìn)行交叉調(diào)控。本研究將三組同源調(diào)控基因cbmR/acyB2、srm22/srm40和orf28/orf27分別與ist基因一起轉(zhuǎn)化到變鉛青鏈霉菌TK24中，共構(gòu)建了包括陽性對照和陰性對照在內(nèi)的9種

6、轉(zhuǎn)化子，對螺旋霉素進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。通過檢測發(fā)酵產(chǎn)物中ISP的產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)雙調(diào)控基因cbmR-acyB2、srm22-srm40對ISP轉(zhuǎn)化率比單調(diào)控基因acyB2、srm40的轉(zhuǎn)化率低，而orf28-orf27卻明顯好于單個調(diào)控基因orf27。其中acyB2和orf28-orf27對提高ist基因的表達(dá)的效果最好，甚至超過強啟動子ermE*p。而在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入4 mM不同的L-氨基酸可明顯提高各轉(zhuǎn)化子的ISP產(chǎn)量，L-Leu的效果最佳。