達托霉素優(yōu)質高效生物合成的調控機制研究.pdf

1、達托霉素是由玫瑰孢鏈霉菌(Streptomyces roseosporus)生產的新型環(huán)脂肽類抗生素，具有廣譜的抗革蘭氏陽性菌活性，為萬古霉素產生耐藥性后的新型微生物藥物。目前，有關達托霉素的分子結構及改造、生物合成機制、抗菌機制及其理化活性等方面已有廣泛研究。達托霉素的發(fā)酵生產過程中產生的同系物A21978C1-3對達托霉素產品的品質影響很大，但同系物的合成如何調控，以及整個生物合成過程的調控機制研究報道較少。本研究針對達托霉素工業(yè)菌

2、玫瑰孢鏈霉菌L30，主要研究多效調控因子對達托霉素生物合成過程的轉錄調控機制，以及支鏈脂?；绑w對同系物合成的調控機制。
　　本文建立了基于Himar1轉座系統(tǒng)的基因組水平調控因子體內篩選體系，以及基于DNA-蛋白親和純化技術的蛋白質組水平調控因子體外篩選體系，成功篩選到重要多效調控因子PhaR和AtrA。實驗表明，PhaR蛋白是達托霉素合成基因簇中dptE基因的負調控因子，phaR基因缺失菌株的達托霉素中試放大發(fā)酵單位較野生型提

3、高了42.5％，達926mg/L;調控因子PhaR通過直接結合dptE基因啟動子抑制達托霉素合成基因簇的表達，進而調控達托霉素的生物合成。PhaR還對自身編碼基因表現出正調控和反饋調控作用，隨著發(fā)酵時間的推移逐漸解除對下游基因的抑制效應。AtrA是TetR家族的轉錄調控因子，在鏈霉菌中非常保守，其通過直接結合dptE基因的啟動子進而正調控達托霉素的生物合成。另一個多效調控因子AdpA是玫瑰孢鏈霉菌A-因子信號通路下游非常保守的效應蛋白，

4、它能夠通過結合atrA基因啟動子正調控atrA基因的表達，從而間接正調控達托霉素合成基因簇的轉錄水平。同時，A-因子信號級聯(lián)途徑中，A-因子受體蛋白ArpA對adpA基因的轉錄具有抑制作用?；诖苏{控機制，我們敲除了arpA基因，使達托霉素的發(fā)酵單位提高了2.5倍。
　　本文同時研究了支鏈脂?；绑w對達托霉素同系物A21978C1-3合成的調控機制。玫瑰孢鏈霉菌基因組上含有兩個支鏈α-酮酸脫氫酶復合體編碼基因簇bkdA1B1C1和

5、bkdA2B2C2，以及與bkdA2B2C2成簇的調控因子基因bkdR。研究發(fā)現BkdR正調控了bkdA2B2C2基因簇的表達，但是對達托霉素合成的正調控作用并非通過影響其基因簇表達;同時BkdR對自身編碼基因的表達有負調控作用。敲除bkdA2B2C2基因簇僅能部分降低發(fā)酵提取物中A21978C1-3同系物組分含量，而敲除bkdA1B1C1基因簇能顯著減少A21978C1-3同系物生成，表明在代謝分解支鏈氨基酸纈氨酸和異亮氨酸合成含支鏈

6、的脂肪酸過程中，bkdA1B1C1基因簇起主導作用，bkdA2B2C2是輔助基因簇。我們構建了同時敲除bkdA1B1C1/bkdA2B2C2基因簇的工程菌，消除A21978C1-3同系物組分生產，實現了達托霉素的優(yōu)質生產。
　　本文揭示了玫瑰孢鏈霉菌中達托霉素合成的轉錄調控機制，以及A-因子介導的級聯(lián)調控機制，通過遺傳改造實現了達托霉素的高效合成;同時闡釋了支鏈脂?；绑w對達托霉素同系物A21978C1-3合成的調控機制，通過定向