犬尿氨酸途徑在達(dá)托霉素生物合成中的功能研究.pdf

1、達(dá)托霉素是由玫瑰孢鏈霉菌(Streptomyces roseosporus)產(chǎn)生的一種天然環(huán)脂肽類抗生素。2003年FDA批準(zhǔn)其用于革蘭氏陽性致病菌引起的并發(fā)性皮膚及皮膚結(jié)構(gòu)感染,隨后于2006年批準(zhǔn)治療由金黃色釀膿葡萄球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌引起的菌血癥和右側(cè)心內(nèi)膜炎。達(dá)托霉素通過破壞細(xì)菌細(xì)胞膜快速殺死病原菌,有效避免細(xì)菌對(duì)其產(chǎn)生耐藥性以及與其它抗生素的交叉感染,逐漸成為治療革蘭氏陽性耐藥茵引起的感染疾病首選用藥。目前關(guān)于達(dá)托霉

2、素的研究主要集中在兩方面:第一,通過傳統(tǒng)的菌種選育方法和發(fā)酵工藝優(yōu)化大幅提高達(dá)托霉素的產(chǎn)量,這些研究為達(dá)托霉素的工業(yè)化生產(chǎn)提供重要基礎(chǔ);第二,通過S.Roseosporus的組合生物學(xué)研究尋找療效更優(yōu)的達(dá)托霉素結(jié)構(gòu)類似物,這些研究揭示了達(dá)托霉素母核上各氨基酸對(duì)其抑菌活性的影響,為尋找療效更佳的達(dá)托霉素類似物提供方向。
　　 大量研究揭示達(dá)托霉素母核氨基酸對(duì)其抑菌活性有重要影響,這些氨基酸在S.roseosporus中的生物合成途

3、徑對(duì)達(dá)托霉素的生物合成有重要作用。犬尿氨酸是達(dá)托霉素的特征氨基酸,是其母核的重要組成部分。在已知抗生素中,犬尿氨酸僅發(fā)現(xiàn)于達(dá)托霉素類抗生素中,它對(duì)達(dá)托霉素的抑菌活性有非常重要的影響,但關(guān)于它在S.roseosporus中的生物合成途徑尚未報(bào)道。在許多微生物中,犬尿氨酸是由色氨酸通過犬尿氨酸途徑分解代謝生成,是此途徑重要的中間產(chǎn)物。犬尿氨酸作為達(dá)托霉素生物合成的重要前體,對(duì)其生物合成具有重要作用。因此,研究犬尿氨酸在S.roseospor

4、us中的生物合成途徑有著非常重要的意義。我們推測S.Roseosporus NRRL11379(v4)中可能存在犬尿氨酸途徑,這條途徑生成的犬尿氨酸可能為達(dá)托霉素生物合成提供前體。研究犬尿氨酸途徑以及此途徑對(duì)達(dá)托霉素生物合成的影響將為代謝工程手段改造菌株和尋找療效更佳的達(dá)托霉素類似物提供重要理論依據(jù)。
　　 目的:
　　 本文旨在研究S.roseosporus NRRL11379(v4)中犬尿氨酸的生物合成途徑和此途徑關(guān)

5、鍵基因?qū)_(dá)托霉素生物合成的影響,為改造S.roseosporus菌株以及尋找療效更佳的達(dá)托霉素類似物提供依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.本研究首先嘗試建立大腸桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng),優(yōu)化接合轉(zhuǎn)移條件,如優(yōu)化抗生素濃度、抗生素覆蓋時(shí)間等。
　　 2.分析S.roseosporus NRRL11379(v4)基因組序列,通過生物信息學(xué)分析找出參與犬尿氨酸生物合成途徑的關(guān)鍵基因。設(shè)計(jì)引物,分別克隆參與此途徑的重要基因:

6、色氨酸2,3-加氧酶(tdo)、犬尿氨酸甲酰胺酶(kynf)、犬尿氨酸酶(kyn)和達(dá)托霉素生物合成基因簇上的dptJ。
　　 3.設(shè)計(jì)引物分別擴(kuò)增tdo、dptJ,kyn基因兩側(cè)同源臂,用重疊PCR將兩端同源臂與卡那霉素抗性基因連接。將目的片段與pKC1139載體構(gòu)建tdo、dptJ和枷基因敲除質(zhì)粒,通過接合轉(zhuǎn)移將導(dǎo)入S.roseosporus NRRL11379(v4)中,接著通過溫敏實(shí)驗(yàn)篩選發(fā)生同源雙交換的基因敲除株(DM

7、),并進(jìn)行PCR驗(yàn)證;擴(kuò)增含有核糖體結(jié)合位點(diǎn)tdo、sptJ基因,與pSET152載體構(gòu)建tdo、dptJ基因過表達(dá)載體。通過接合轉(zhuǎn)移,篩選tdo、dptJ過表達(dá)株(OM)和遺傳互補(bǔ)株(DMC),并進(jìn)行驗(yàn)證。重組菌株培養(yǎng)后收集菌液,進(jìn)行生物活性檢測和定量。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功建立大腸桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng),可以得到目的接合子。受體菌孢子最佳熱激條件為50℃熱激10 min;抗生素最佳覆蓋時(shí)間為16-18h;抗生

8、素最佳覆蓋濃度為安普霉素(Apr)10μg/ma和萘啶酮酸(NA)25μg/ml。
　　 2.從S.roseosporus NRRL11379(v4)基因組中克隆出犬尿氨酸途徑的三個(gè)關(guān)鍵基因tdo(849bp),kynf(933 bp),kyn(1233 bp)以及達(dá)托霉素生物合成基因簇上的dptj(738 bp)基因。生物信息學(xué)表明tdo編碼色氨酸2,3-雙加氧酶,kynf編碼犬尿氨酸甲酰胺酶,枷編碼犬尿氨酸酶,這些基因序列和

9、基因位置都較保守。另外,重組蛋白KYN以犬尿氨酸為底物生成鄰氨基苯甲酸,進(jìn)一步確定S.roseosporusNRRL11379(v4)中含有犬尿氨酸途徑。
　　 3.成功構(gòu)建tdo、dptJ和kyn敲除載體和tdo、dptJ過表達(dá)載體。根據(jù)同源重組原理,溫敏實(shí)驗(yàn)后獲得陽性菌株。PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示相應(yīng)基因敲除成功,獲得敲除突變株tdo DM、dptJ,DM,kyn DM,同源重組幾率分別為4%、0.4%和11%。將犬尿氨酸途徑第一

10、步反應(yīng)中的tdo基因敲除后,達(dá)托霉素的產(chǎn)量降低55%;將達(dá)托霉素生物合成簇dntJ鼓除后產(chǎn)量降低58%;分別遺傳回補(bǔ)后產(chǎn)量得到增加。將犬尿氨酸途徑第三步反應(yīng)中的kyn敲除后,產(chǎn)量增加33.75%。將tdo、dptJ表達(dá)載體導(dǎo)入S.roseosporusNRRL11379(v4)基因組后,獲得tdo OM和dptJOM,產(chǎn)量分別增加了7%和112%。
　　 結(jié)論:
　　 本文結(jié)果顯示S.roseosporus NRRL11