鏈霉菌中的嘧啶代謝補(bǔ)償途徑及其對(duì)多氧霉素生物合成的影響.pdf

1、多氧霉素(Polyoxin)是可可鏈霉菌(Streptomyces cacaoi)產(chǎn)生的嘧啶核苷二肽抗生素,它能夠競(jìng)爭(zhēng)性抑制幾丁質(zhì)合成酶的活性,具有良好的抗真菌活性。多氧霉素不是一種單純的物質(zhì),因?yàn)槠涮兼溕蟁1(結(jié)合于嘧啶環(huán)上,可以是氫、甲基、羥甲基或者羧基)、R2(位于其中一個(gè)氨基酸)和R3(位于另一個(gè)氨基酸)三個(gè)位點(diǎn)上官能團(tuán)的變化導(dǎo)致其組份有A～N14種之多。多氧霉素生物合成基因簇在不產(chǎn)多氧霉素的變鉛青鏈霉菌中異源表達(dá),只能檢測(cè)到H

2、組份(R1位點(diǎn)為甲基)。這表明在多氧霉素生物合成基因簇之外還有修飾基因(氧化基因)在起作用,影響著多氧霉素組份多樣性(R1位點(diǎn))的形成。本研究的任務(wù)之一是克隆該氧化酶基因,揭示多氧霉素多組份形成的機(jī)制(R1位點(diǎn))。
　　 分析真菌的胸腺嘧啶代謝補(bǔ)償途徑(胸腺嘧啶氧化變成5-羥甲基尿嘧啶、5-醛基尿嘧啶、5-羧基尿嘧啶,然后脫羧變成尿嘧啶),發(fā)現(xiàn)補(bǔ)償途徑的出發(fā)底物(對(duì)應(yīng)于R1位點(diǎn)為甲基的多氧霉素),代謝中間體(對(duì)應(yīng)于R1位點(diǎn)為羥甲

3、基和羧基的多氧霉素)以及代謝產(chǎn)物(對(duì)應(yīng)于R1位點(diǎn)為氫的多氧霉素)與各種多氧霉素組份的核苷部分一一對(duì)應(yīng)。該胸腺嘧啶代謝補(bǔ)償途徑只在真菌(如粗糙脈孢霉和粘紅酵母)中報(bào)道有存在,在細(xì)菌和其它高等生物中未見(jiàn)報(bào)道。BLAST比對(duì)從阿維鏈霉菌中找到了胸腺嘧啶補(bǔ)償途-徑的一個(gè)關(guān)鍵酶,胸腺嘧啶-7-羥化酶(Thase,催化胸腺嘧啶氧化變成5-羥甲基尿嘧啶、5-醛基尿嘧啶、5-羧基尿嘧啶),的潛在編碼基因SAV4805;從天藍(lán)色鏈霉菌中找到了胸腺嘧啶補(bǔ)償

4、途徑的另一個(gè)關(guān)鍵酶,異乳清酸脫羧酶(IDCase,催化5-羧基尿嘧啶即異乳清酸脫羧變成尿嘧啶)的潛在編碼基因SCO_6305。這暗示鏈霉菌(代表了與真菌處于不同分類(lèi)地位的細(xì)菌)中可能存在有胸腺嘧啶代謝補(bǔ)償途徑。
　　 將含有多氧霉素生物合成基因簇的cosmid m5A7在阿維鏈霉菌(不產(chǎn)多氧霉素)中異源表達(dá),除檢測(cè)到多氧霉素H組份(R1位點(diǎn)為甲基)以外,還檢測(cè)到多氧霉素A組份(R1位點(diǎn)為羥甲基)。將阿維鏈霉菌的開(kāi)放閱讀框SAV4

5、805加載紅霉素抗性基因強(qiáng)啟動(dòng)子P-ermE*后與含有多氧霉素生物合成基因簇的cosmid m5A7在變鉛青鏈霉菌(不產(chǎn)多氧霉素)中共表達(dá),除檢測(cè)到多氧霉素H組份以外,還檢測(cè)到多氧霉素A組份。這表明阿維鏈霉菌來(lái)源的Thase編碼基因SAV4805可以提高多氧霉素生物合成的組份多樣性。
　　 為測(cè)試開(kāi)放閱讀框SAV_4805編碼蛋白催化反應(yīng)的直接作用底物,通過(guò)大腸桿菌pET28a/BL21系統(tǒng)超量表達(dá)了SAV4805·(His)6

6、融合蛋白,以胸腺嘧啶為底物,參照真菌Thase催化的反應(yīng)設(shè)計(jì)反應(yīng)體系進(jìn)行體外反應(yīng)。LC-MS檢測(cè)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)預(yù)期底物5-羥甲基尿嘧啶或5-羧基尿嘧啶的產(chǎn)生。鑒于體外生化反應(yīng)失敗的事實(shí),我們想通過(guò)喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)間接證實(shí)開(kāi)放閱讀框SAV4805編碼蛋白的催化底物是什么.如果SAV4805蛋白的催化底物是胸腺嘧啶,那么在搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)多氧霉素的時(shí)候添加化學(xué)合成的5-羥甲基尿嘧啶和5-羧基尿嘧啶(SAV4805蛋白的預(yù)期催化產(chǎn)物)則能夠起到開(kāi)放閱讀框SAV

7、4805相同的功能,即提高多氧霉素生物合成組份的多樣性。遺憾的是添加5-羥甲基尿嘧啶沒(méi)有檢測(cè)到多氧霉素A組份(R1位點(diǎn)為羥甲基)的產(chǎn)生,添加5-羧基尿嘧啶沒(méi)有檢測(cè)到多氧霉素F組份(R1位點(diǎn)為羧基)的產(chǎn)生。開(kāi)放閱讀框SAV4805編碼蛋白的直接催化底物是什么,還有待進(jìn)一步研究。
　　 通過(guò)同源交換敲除阿維鏈霉菌開(kāi)放閱讀框SAV_4805后,突變株在SFM培養(yǎng)基上能夠正常生長(zhǎng),沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的表型變化。這表明開(kāi)放閱讀框SAV4805是

8、一個(gè)奢侈基因,不為阿維鏈霉菌的生長(zhǎng)所必需。為調(diào)查開(kāi)放閱讀框sAV4805和SCO6305能否構(gòu)成一個(gè)完整的從胸腺嘧啶到尿嘧啶的補(bǔ)償途徑,本研究通過(guò)敲除二羥乳清酸合成酶基因dih打斷了阿維鏈霉菌的UMP從頭合成途徑。Dih-突變株在培養(yǎng)基中添加尿嘧啶的情況下可以正常生長(zhǎng),否則不能正常生長(zhǎng)。將天藍(lán)色鏈霉菌開(kāi)放閱讀框SCO_6305加載紅霉素抗性基因強(qiáng)啟動(dòng)子P-ermE*后導(dǎo)入dih-突變株,創(chuàng)建一個(gè)嘧啶代謝補(bǔ)償途徑。但是攜帶創(chuàng)建的嘧啶代謝補(bǔ)

9、償途徑的dih-突變株在培養(yǎng)基中添加胸腺嘧啶的情況下仍然不能正常生長(zhǎng),這表明創(chuàng)建的胸腺嘧啶代謝補(bǔ)償途徑不能正常工作,即胸腺嘧啶不能成功被轉(zhuǎn)化成尿嘧啶。分析認(rèn)為這可能是因?yàn)镾AV4805蛋白的氧化能力不如Thase,嘧啶環(huán)上的7為甲基只能被氧化成羥甲基不能被氧化成羧基,因?yàn)閟AV4805提高多氧霉素生物合成的組份只能檢測(cè)到R1位點(diǎn)是羥甲基的A組份,沒(méi)有檢測(cè)到R1位點(diǎn)是羧基的F組份。或者,SAV4805蛋白的直接催化底物是TMP而不是胸腺嘧