恰塔努加鏈霉菌中納他霉素生物合成調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、納他霉素屬于多烯大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，是一種高效、廣譜、安全的抗真菌劑。納他霉素是鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，但目前較低的發(fā)酵水平造成了其生產(chǎn)成本較高，限制了其進(jìn)一步的使用。本研究以一株具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的納他霉素工業(yè)高產(chǎn)菌株恰塔努加鏈霉菌L10(Streptomyces chattanoogensisvar.L10)為研究材料，對(duì)其納他霉素生物合成基因簇、參與途徑特異性調(diào)控和多效調(diào)控的多個(gè)調(diào)控因子進(jìn)行了深入的研究，探索其高產(chǎn)的分子機(jī)制，并

2、為利用基因工程技術(shù)構(gòu)建納他霉素工業(yè)高產(chǎn)菌奠定基礎(chǔ)。
　　 本研究首先通過(guò)文庫(kù)構(gòu)建、文庫(kù)篩選和染色體步移等方法克隆了L10中的納他霉素生物合成基因簇scn，并通過(guò)對(duì)兩個(gè)途徑特異性正調(diào)控基因scnRⅠ和scnRⅡ的敲除進(jìn)行了驗(yàn)證。采用5'RACE和RT-PCR技術(shù)全面分析了scn基因簇的轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)。體外凝膠阻滯電泳實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)轉(zhuǎn)錄分析表明ScnRⅡ能夠直接激活scn基因簇內(nèi)全部基因的表達(dá)，而ScnRⅠ則是間接影響基因簇內(nèi)所有基因的轉(zhuǎn)錄。

3、通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)scn基因簇與納他爾鏈霉菌中的同源基因簇pim進(jìn)行了比較基因簇分析，結(jié)果表明兩個(gè)基因簇不僅具有不同的基因構(gòu)成，而且具有不同的轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)，并發(fā)現(xiàn)scn基因簇可能是恰塔努加鏈霉菌通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移而得到。兩個(gè)基因簇轉(zhuǎn)錄水平的比較也為抗生素生物合成基因簇的進(jìn)化研究提供了新的思路。
　　 本研究還通過(guò)同源克隆的方法得到了參與L10中形態(tài)分化與次級(jí)代謝等過(guò)程調(diào)控的adpA-Ch和丁內(nèi)酯CHB調(diào)控系統(tǒng)相關(guān)基因scgA、scg

4、X和scgR。基因敲除和轉(zhuǎn)錄水平分析表明adpA-Ch是形態(tài)分化與次級(jí)代謝過(guò)程(黃色素和納他霉素生物合成等)的正調(diào)控基因，在其敲除菌株ZJUD5(△adpA)中納他霉素生物合成的途徑特異性正調(diào)控基因scnRⅠ的轉(zhuǎn)錄水平顯著下降，僅為出發(fā)菌株L10的5％左右，而scnRⅡ的mRNA豐度并沒(méi)有顯著變化。表明adpA-Ch對(duì)納他霉素的生物合成的調(diào)控至少是部分通過(guò)對(duì)scnRⅠ的調(diào)控來(lái)實(shí)行的。但凝膠阻滯電泳實(shí)驗(yàn)表明AdpA-Ch并不能直接結(jié)合在s

5、cnRⅠ的啟動(dòng)子上，因此其對(duì)scnRⅠ的調(diào)控是間接調(diào)控，可能是通過(guò)某個(gè)中間調(diào)控基因介導(dǎo)的。
　　 L10中的丁內(nèi)酯信號(hào)分子CHB調(diào)控系統(tǒng)包括scgA、scgX和scgR，其中ScgR編碼CHB受體蛋白，scgA和scgX編碼參與CHB生物合成的合成酶?；蚯贸龑?shí)驗(yàn)表明CHB系統(tǒng)是L10形態(tài)分化與納他霉素合成等次級(jí)代謝過(guò)程正確起始所必須的，CHB缺失的突變株表現(xiàn)出生長(zhǎng)缺陷和形態(tài)分化與次級(jí)代謝等過(guò)程滯后等現(xiàn)象，同時(shí)碳源依賴(lài)性表型表明

6、CHB也參與了碳源利用等過(guò)程。凝膠阻滯電泳實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)轉(zhuǎn)錄分析揭示了CHB受體蛋白ScgR能夠結(jié)合在合成酶ScgA的啟動(dòng)子上抑制其轉(zhuǎn)錄，而ScgR的DNA結(jié)合活性能夠受到CHB的抑制，這些結(jié)果表明CHB生物合成受到其自身正反饋調(diào)控，同時(shí)在scgA與scgX的基因缺失株中scgA的mRNA豐度顯著上升，暗示著CHB生物合成還受到其自身介導(dǎo)的負(fù)反饋調(diào)控系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。采用Genomic SELEX技術(shù)篩選到CHB系統(tǒng)下游的另一個(gè)靶基因gbdA，但

7、其突變株表型分析顯示gbdA并不介導(dǎo)CHB下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。同時(shí)對(duì)scnRⅠ和scnRⅡ及其整個(gè)納他霉素生物合成基因簇的轉(zhuǎn)錄分析表明CHB系統(tǒng)對(duì)納他霉素生物合成的調(diào)控可能是位于前體水平的調(diào)控。比較蛋白質(zhì)組學(xué)揭示了CHB系統(tǒng)的調(diào)控元包括至少50個(gè)以上的基因，受其正調(diào)控的蛋白主要為參與糖酵解、TCA循環(huán)、磷酸戊糖途徑、核酸和氨基酸合成、脅迫應(yīng)答、能量代謝和蛋白質(zhì)合成等過(guò)程的蛋白。而受CHB負(fù)調(diào)控的蛋白主要為參與碳源攝取與代謝等過(guò)程的酶類(lèi)。研究