淀粉酶產色鏈霉菌1628合成豐加霉素關鍵基因的研究.pdf

1、豐加霉素（Toyocamycin，TM）是核苷類抗生素家族中的一員。它在抑制真菌方面表現(xiàn)出很高的活性，在植物病害防治領域具有重要的應用潛力。本論文針對TM生產菌株淀粉酶產色鏈霉菌（Streptomyces diastatochromogenes）1628產量低等問題，克隆了涉及S. diastatochromogenes1628豐加霉素生物合成的多個功能基因，利用代謝工程手段有效提高了S. diastatochromogenes1628

2、的豐加霉素的合成水平。
　　首先，以S. diastatochromogenes1628 DNA為模板，設計簡并引物，克隆得到參與TM生物合成大小分別為1443 bp的toyF（編碼腺苷酸琥珀酸裂解酶）（GenBank登錄號：JQ267374）和1284 bp的toyG（編碼腺苷琥珀酸合成酶）基因（GenBank登錄號：KF517415），其分別與已公布的多株鏈霉菌對應基因的氨基酸序列具有很高的相似性，其中與S. venezuel

3、ae ATCC10712的氨基酸序列同源性最高，分別為90％和95%。將toyF和toyG基因分別置于鏈霉菌整合型載體 pIB139中的PermE*啟動子下游，構建了重組載體 pIB139-toyF和pIB139-toyG，通過接合轉移法獲得重組菌1628-TOYF和1628-TOYG。將原始菌株1628與重組菌1628-TOYF、1628-TOYG進行TM發(fā)酵、酶活分析及細胞干重檢測。重組菌中的TM產量和相應的酶活TOYF(TOYG)

4、均高于原始菌。其中，重組菌1628-TOYG TM產量增幅最高達26.2%。
　　其次，以S. diastatochromogenes1628 DNA為模板，設計簡并引物，克隆了大小為558bp編碼核糖體再循環(huán)因子frr基因，其與Streptomyces flavogriseus ATCC33331、Streptomyces venezuelae ATCC10712和Streptomyces sp. NRRL F-2580菌株的F

5、rr氨基酸序列同源性最高，分別為92%、92%和89%。在S. diastatochromogenes1628中過量表達了frr基因，獲得重組菌1628-FRR（整合pIB139-frr）。1628-FRR與原始菌株1628發(fā)酵性能相比，TM產量增加了41.1%，細胞干重增長了21%，發(fā)酵時間從84 h縮短至72 h。通過RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，與原始菌株1628相比，重組菌1628-FRR中基因toyF和toyG轉錄水平均有提高，且基因

6、toyG轉錄水平增加更為明顯。另外，利用基于綠色熒光蛋白（GFP）的熒光強度檢測實驗發(fā)現(xiàn)，frr基因的過量表達能加速蛋白合成，發(fā)酵過程中后期此效果尤為顯著，從而導致TM產量的提高。
　　最后，將toyG基因分別與frr以及編碼透明顫菌血紅蛋白（Vitreoscilla hemoglobin）的vgb基因串聯(lián)，以及三基因串聯(lián)表達考察對1628菌株合成TM的影響。發(fā)酵結果顯示，在構建的多株重組菌中，vgb、frr和toyG基因分別置于