家蠶腸道產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌的分離鑒定及其酶基因的克隆.pdf

1、家蠶是產(chǎn)生較大經(jīng)濟效益和社會效益的重要經(jīng)濟昆蟲，家蠶腸道微生物對其生長發(fā)育及微生態(tài)平衡具有重要作用。目前國內(nèi)外關(guān)于家蠶腸道微生物的研究報道，多集中于腸道微生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、菌群致病性等方面，而關(guān)于家蠶腸道菌應(yīng)用于產(chǎn)酶益生菌的研究較少。腸道產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌，可幫助宿主更好地消化淀粉等營養(yǎng)物質(zhì)，此外該類菌還有許多其它的益生功能。近些年來，關(guān)于益生菌在動物微生態(tài)制劑方面的應(yīng)用，多集中于水產(chǎn)類及家禽生產(chǎn)中，而蠶用益生菌的研究未見報道，蠶業(yè)生產(chǎn)過程中一直

2、存在著葉絲轉(zhuǎn)化率較低，蠶病發(fā)生率高等問題，因而研究蠶腸道菌及其產(chǎn)酶并對產(chǎn)酶基因進(jìn)行原核表達(dá)分析，在改善蠶腸微生態(tài)環(huán)境及蠶人工飼料開發(fā)上有一定意義。
　　 本文從大造品種家蠶5齡幼蟲腸道中通過傳統(tǒng)培養(yǎng)法分離純化出部分可培養(yǎng)細(xì)菌，通過含淀粉的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基篩選得到其中兩株產(chǎn)淀粉酶菌株，用細(xì)菌擴增通用引物分別對產(chǎn)酶菌進(jìn)行16SrDNA序列擴增并克隆測序，將所得測序結(jié)果與GenBank已有序列進(jìn)行比對，該兩株菌均與蠟樣芽孢桿菌序列有

3、99％的同源性，結(jié)合菌落形態(tài)學(xué)觀察及菌體細(xì)胞革蘭氏染色涂片顯微鏡鏡檢分析結(jié)果，鑒定所得菌株為芽孢桿菌屬蠟樣芽孢桿菌，DNS法測定菌株所產(chǎn)淀粉酶酶活，結(jié)果顯示，該家蠶腸源性細(xì)菌所產(chǎn)酶具一定酶活力，且菌株的16SrDNA序列也與已有報導(dǎo)的蠟樣芽孢桿菌序列有一定差異，因而具有一定的研究意義。
　　 鑒定得知分離產(chǎn)酶菌種屬后，根據(jù)已解析的蠟樣芽孢桿菌α淀粉酶(Ec.3.2.1.1)基因設(shè)計引物，從該兩株細(xì)菌的基因組DNA中分別擴增出了產(chǎn)

4、淀粉酶基因片段，經(jīng)克隆、測序和分析獲得了家蠶腸源性蠟樣芽孢桿菌淀粉酶基因的完整編碼區(qū)ORF框序列，產(chǎn)酶基因擴增分別得到3414、3378個堿基序列，均包括完整的編碼區(qū)1761bp，可編碼586個氨基酸，比對分析屬于α淀粉酶超級家族，但這兩株菌的產(chǎn)酶基因序列存在一定差異，其中，Dza號菌793位堿基為T，而DZh為C，Dza號菌1381位堿基為A，DZh為G，對應(yīng)的氨基酸序列Dza號菌265位氨基酸為S，DZh為P，Dza號菌461位氨基

5、酸為I，而DZh為V。將Dza號菌α淀粉酶基因在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行原核表達(dá)，得到分子量為66kD左右的目的蛋白，與DNAStar軟件預(yù)測產(chǎn)物蛋白大小相符合。
　　 根據(jù)該編碼區(qū)序列設(shè)計含酶切位點的引物重新擴增獲得目的基因序列，連接到表達(dá)載體pET28a(+)構(gòu)建了該產(chǎn)酶基因的原核表達(dá)載體，經(jīng)酶切鑒定后將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到含稀有密碼子編碼氨基酸的大腸桿菌宿主細(xì)胞Transetta（DE3）中，用IPTG進(jìn)行了不同濃度的誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)