從土壤中分離產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌實驗方案

1、0土壤中產(chǎn)淀粉酶芽胞桿菌的篩選及其淀粉酶活力的測定設(shè)計性實驗方案一、綜述：一、綜述：淀粉酶是淀粉降解酶。它們廣泛存在于微生物、植物和動物體中。它們將淀粉及相關(guān)的聚合物分解為帶有具體淀粉分解酶特征的產(chǎn)品。淀粉酶廣泛存在于動植物和微生物中是最早用于工業(yè)生產(chǎn)并且迄今仍是用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑產(chǎn)品之一。淀粉酶種類繁多特點各異可應用于造紙、印染、釀造、果汁和食品加工、醫(yī)藥、洗滌劑、工業(yè)副產(chǎn)品及廢料的處理、青貯飼料及微生態(tài)制劑]等多種領(lǐng)域。在釀

2、造發(fā)酵工業(yè)如酒精生產(chǎn)、啤酒制造、發(fā)酵原料液化及糖化工藝過程中均有重要價值如添加淀粉酶分布非常廣泛，是人們經(jīng)常研究的一種酶。從紡織工業(yè)到廢水處理，這些酶都有不同規(guī)模的應用【1】。常見產(chǎn)淀粉酶的主要為芽孢桿菌屬。其中的常見產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌菌種有：地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌【2】、凝結(jié)芽孢【3】。由于芽孢桿菌屬是一類好氧或兼性厭氧、產(chǎn)生抗逆性內(nèi)生抱子的桿狀細菌，許多為腐生菌，主要分布于土壤和植物體表面及水體中【4

3、】。所以此次實驗從土壤中分離產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌。二、實驗目的要求二、實驗目的要求1了解生物分離提純的原理和方法技術(shù)2掌握從土壤中篩選產(chǎn)淀粉酶菌株的原理和方法3.掌握微生物搖瓶培養(yǎng)方法及淀粉酶活力測定的原理和方法4.培養(yǎng)學生的綜合應用微生物實驗方法的能力5.培養(yǎng)學生自行設(shè)計實驗流程、綜合分析問題解決問題和判斷實驗結(jié)果的能力。三、實驗原理三、實驗原理自然界中，土壤是微生物生活最適宜的環(huán)境。土壤具有微生物進行生長繁殖和生命活動中所需的各種條件

4、。土壤中微生物的數(shù)量因土壤類型、季節(jié)、土層深度與層次等不同而異。一般地說，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影響，微生物不易生存，離地表10cm～30cm的土層中菌數(shù)最多，隨土層加深，菌的數(shù)量減少【5】。從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物分離與純化。平板分離法普遍用于微生物的分離與純化。其基本原理是選擇適合與待分離微生物的生長條件，如營養(yǎng)成分、酸堿度、溫度和氧等要求，或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生

5、長，而抑制其他微生物生長的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物。值得指出的是，從微生物群體中經(jīng)分離生長在平板上的單個菌落并不一定保證是純培養(yǎng)。因此，純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外，還要結(jié)合顯微鏡檢測個體形態(tài)特征后才能確定，有些微生物的純培養(yǎng)要經(jīng)過一系列分離與純化過程和多種特征鑒定才能得到。芽孢桿菌屬的共同特征是：革蘭氏陽性；接觸酶陽性；水解淀粉；VP試驗陽性；不產(chǎn)生吲哚；苯甲氨酸不脫氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不產(chǎn)生二羥丙酮；營養(yǎng)體的最高生

6、長溫度大約從25℃到75℃以上；最低生長溫度大約5℃到45℃；生長最低pH值，從7.5—8到2左右；耐鹽范圍從低于2%的NaCl到25%NaCl；營養(yǎng)明膠（22℃）7天內(nèi)液化1厘米或1厘米以上?？莶菅挎邨U菌和地衣芽孢桿菌在糖發(fā)酵試驗用阿拉伯糖，木糖和2恒溫搖床恒溫培養(yǎng)箱高壓蒸汽滅菌箱超凈工作臺水浴箱紫外燈照射箱磁力攪拌器玻璃珠移液管涂布器顯微鏡五、實驗方法及步驟五、實驗方法及步驟1、初篩方法、初篩方法①制菌懸液制菌懸液：兩個土樣分別取5

7、g，放入各自裝有45mL無菌水的三角瓶，振蕩10min即為稀釋101的土壤懸浮液。每個環(huán)境的土樣裝1個錐形瓶，共2個，同時將其分為4組，編號AB。②加熱篩選有芽孢的菌加熱篩選有芽孢的菌：將2個錐形瓶加塞、包扎、搖勻（無菌室里），利用恒溫水浴裝置100℃左右水浴，水浴鍋溫度恒定后維持15min（制懸液時就應先開始加熱），制成101gml的土壤懸液③梯度稀釋菌懸液：梯度稀釋菌懸液：再分別另取裝有9mL無菌水試管5支，用記號筆編上102、10

8、3、104、105。取已稀釋成101土壤液，振蕩后靜止0.5min，用無菌的移液器吸取1mL土壤懸液加入102的無菌水的試管中，并在試管內(nèi)輕輕反復吹吸數(shù)次，使之充分混勻，即成102土壤稀釋液。同法從102的試管中吸取1mL稀釋液加入編號為103的無菌水試管中，混勻后即為103土壤稀釋液，依次連續(xù)稀釋為104、105土壤稀釋液。在土壤稀釋過程中，用相同的移液槍頭由濃到稀來稀釋。④涂布平板涂布平板用一支新的無菌槍頭，由低濃度開始，從各濃度土

9、壤稀釋液中各吸取100ul，對號較均勻地放入已寫好稀釋度的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，用灼燒冷卻后的無菌玻璃涂棒涂勻。每個濃度做3個平板（重復）。37℃下恒溫培養(yǎng)24h。2、復篩方法、復篩方法【1】劃線接種（分區(qū)劃線法）劃線接種（分區(qū)劃線法）：在上述不同稀釋度培養(yǎng)基中挑取不同形態(tài)的單菌落進行分區(qū)劃線，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第1次平行劃線3~4條，再轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿約60角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過第1次劃線部分作第2次平行劃線，再用

10、同法通過第2次平行劃線部分作第3次平行劃線和通過第3次平行劃線部分作第4次平行劃線（如右圖）。劃線完畢，蓋上皿蓋，倒置于28~29C溫室中培養(yǎng)約20h.。再繼續(xù)分區(qū)劃線23次，以獲得較純的菌種。將純化得到的單菌落分為兩部分，其中一部分接種到培養(yǎng)基內(nèi)，用以保存菌種，另一部分用來做染色實驗。3、獲得產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌純種、獲得產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌純種：上述劃線接種后的菌落中各挑取形態(tài)特征不一致的點接于倒好的淀粉牛肉膏培養(yǎng)基中，一個土樣取8個平板兩

11、兩標記同一位置同序號標記，一平板分5個區(qū)域，點接重復兩次，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。上述點接后的平板中取出一組四個分好區(qū)域的淀粉牛肉膏培養(yǎng)基平板于實驗室，其他置于無菌室。實驗室里，四個平板均加入碘液，立即觀察記錄陽性和陰性菌落所在位置，并可同時記錄透明圈的大小。根據(jù)所記錄的陽性菌的編號，利用另一組中的營養(yǎng)瓊脂平板上其對應的菌落繼續(xù)劃線接種，培養(yǎng)后將出現(xiàn)的形態(tài)特征不一致的菌落進行編號，然后挑取部分出來進行革蘭氏染色鏡檢，若發(fā)現(xiàn)視野內(nèi)出現(xiàn)