耐高溫α-淀粉酶菌株的篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化及酶基因的克隆.pdf

1、耐高溫α-淀粉酶是目前最重要的工業(yè)酶制劑之一，約占酶制劑市場(chǎng)25％的比例。耐高溫α-淀粉酶能在較高溫度下能夠有效快速的分解淀粉，被廣泛應(yīng)用于紡織退漿、發(fā)酵、制糖等高溫條件下生產(chǎn)工業(yè)?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis）是國(guó)內(nèi)生產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶的代表菌株之一。 為了獲得紡織工業(yè)中所需求的耐高溫α-淀粉酶，從枯草堆、農(nóng)田積肥、下水道等處土樣中分離得到一株能向胞外分泌耐高溫α-淀粉酶的菌株并對(duì)其所產(chǎn)酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研

2、究。通過(guò)生理生化及分子生物學(xué)鑒定，鑒定該菌為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），并初步命名為Bacillus subtilis C1。Bacillus subtilis C1在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中（pH7，溫度45℃）培養(yǎng)24 h左右達(dá)到生長(zhǎng)穩(wěn)定期，在68 h時(shí)酶活達(dá)到最高，為185.6 u·mL-1。對(duì)該菌株分泌的耐高溫α-淀粉酶的性質(zhì)研究表明，此α-淀粉酶最適作用pH值為6，最適溫度為70℃。酶的耐熱性能較好，在70℃下處理

3、1h，仍具有81％的酶活，適合紡織品高溫退漿的需要。 為了獲得較高的酶活和產(chǎn)量，在實(shí)驗(yàn)中，利用Minitab軟件中Plackett-Burman設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法，對(duì)耐高溫α-淀粉酶產(chǎn)生菌Bacillus subtilis C1的發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。在單次單因子法得出的適宜條件基礎(chǔ)之上，綜合考慮了所有影響酶活的因素，并對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，得到了Bacillus subtilis C1產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶的最佳培養(yǎng)條件。結(jié)

4、果表明：優(yōu)化培養(yǎng)基的組成（200 mL）為麩皮2.16 g，棉粕粉1.98 g，酵母粉0.40 g，NaCl1.00 g，CaCl20.40 g，淀粉0.10 g。該營(yíng)養(yǎng)條件下的酶活為2329 u·mL-1，約是培養(yǎng)基優(yōu)化前酶活的12.6倍，酶活有了顯著的提高。 根據(jù)Gene Bank中已知的α-淀粉酶基因保守序列設(shè)計(jì)出特異性引物，通過(guò)PCR方法從Bacillus subtilis C1基因組DNA中擴(kuò)增出了預(yù)期的1.5 kb左