利用核糖體工程技術(shù)改造豐加霉素生產(chǎn)菌株Streptomyces diastatochromogenes 1628的研究.pdf

1、豐加霉素（Toyocamycin，TM）是核苷類抗生素家族中重要成員之一，因其高效低毒低殘留的特性，其在農(nóng)業(yè)植物真菌病害的防治中具有廣闊的應用前景。課題組前期篩選到一株產(chǎn)豐加霉素菌株淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628（Streprtomyces diastatochromogenes1628），由于其產(chǎn)量較低，難以實現(xiàn)豐加霉素大規(guī)模的生物合成。近期大量研究表明，核糖體工程技術(shù)可有效提高微生物合成次級代謝產(chǎn)物的能力。因此，本論文嘗試利用核糖體工程技

2、術(shù)改造菌株S.diastatochromogenes1628，以期大幅度提高豐加霉素的產(chǎn)量，并對獲得的代表性菌株進行特性分析，為今后闡明高效合成豐加霉素的分子機理提供理論基礎(chǔ)。本文的研究工作如下：
　　首先，選擇利福平（Rif）、慶大霉素（Gen）、鏈霉素（Str）等抗生素篩選S.diastatochromogenes1628抗性突變株，觀察不同抗性類型突變株合成TM的能力變化以及分析遺傳穩(wěn)定性。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與原始菌株相比，獲得

3、的40株Str抗性（Strr）突變株中有2株TM產(chǎn)量有細微增加（小于1倍）;100株Gen抗性（Genr）突變株有3株產(chǎn)素有小幅提高（1-2倍），但遺傳穩(wěn)定性差；篩選獲得Rif抗性（Rifr）突變株共120株，其中有9株TM產(chǎn)量明顯提高，且遺傳穩(wěn)定性好。其中Rifr突變株1628-T15的TM產(chǎn)量最高達689.3mg/L，為原始菌株產(chǎn)量的4.5倍；而Rifr突變株1628-T62的TM產(chǎn)量明顯降低，只有原始菌株產(chǎn)量的20％。
　　

4、其次，對代表性的Rifr突變株1628-T15與1628-T62的相關(guān)特性進行了研究。Rifr突變株1628-T15與1628-T62的RNA聚合酶β亞基的編碼基因rpoB的變化位點分別為A1310G和C1328G，導致的氨基酸變化為His437Arg和Ala443Gly。掃描電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)：突變株1628-T15與原始菌株的菌株形態(tài)變化不大；而突變株1628-T62的細胞形態(tài)和產(chǎn)孢能力受到較大影響。利用RT-PCR技術(shù)考察了原始菌株、突

5、變株1628-T15和1628-T62中涉及豐加霉素生物合成的編碼基因toyG和形態(tài)調(diào)控基因adpAsd的轉(zhuǎn)錄水平的變化。結(jié)果顯示，突變株1628-T15的toyG的轉(zhuǎn)錄水平要高于原始對照，而二者的adpAsd的轉(zhuǎn)錄水平幾乎無區(qū)別。突變株1628-T62的toyG基因和adpAsd基因的轉(zhuǎn)錄水平都明顯低于原始菌株，實驗結(jié)果與突變株的產(chǎn)素水平和細胞形態(tài)變化結(jié)果相一致。另外，利用GUS為報告基因的結(jié)果顯示，突變株1628-T15與1628-

6、T62與原始菌株的蛋白合成水平無明顯差異。
　　最后，將adpAsd基因置于載體pIB139中的PermE*啟動子下游，構(gòu)建了重組載體pIB139-adpAsd，通過接合轉(zhuǎn)移的方式導入突變株1628-T62中獲得重組菌1628-T62A。實驗觀察發(fā)現(xiàn)：重組菌1628-T62A的產(chǎn)孢能力明顯強于突變株1628-T62，且與突變菌株1628-T62相比，重組菌1628-T62A的TM產(chǎn)量提高了近3倍。該實驗表明adpAsd基因涉及調(diào)控