利用基因組工程技術(shù)改造漢遜酵母生產(chǎn)甘油和紫杉醇.pdf

1、甘油（ Glycerol）又稱丙三醇，是主要的化工原料，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工和護(hù)理等行業(yè)。由于其用途廣泛、新附加值產(chǎn)品不斷出現(xiàn)，導(dǎo)致甘油用量急劇增加。目前，我國(guó)的甘油主要依賴進(jìn)口，為保證穩(wěn)定、高效的供給，亟需尋找新的生產(chǎn)方法。微生物發(fā)酵法由于不受原料的限制、生產(chǎn)過(guò)程綠色清潔，因而具有很大的優(yōu)勢(shì)，其中，微生物代謝工程的發(fā)展為實(shí)現(xiàn)構(gòu)建微生物高產(chǎn)細(xì)胞工廠提供了有力的支撐。
　　紫杉醇（ Paclitaxel，商品名 Taxol）

2、為三環(huán)二萜類生物堿，是目前唯一一種可以促進(jìn)微管束聚合和穩(wěn)定已聚合微管束阻斷細(xì)胞正常分裂的藥物，是治療卵巢癌、乳腺癌等癌癥的主流藥物之一。紫杉醇主要來(lái)源于藥用植物紅豆杉樹(shù)皮中，但紅豆杉的生長(zhǎng)周期特別長(zhǎng)，且紫杉醇含量也特別低。因此，為解決嚴(yán)重的供需矛盾，亟需尋求紫杉醇新藥源途徑以滿足臨床上日益增長(zhǎng)的需求。近來(lái)年，離子束生物工程技術(shù)作為一種全新的育種方法，因其獨(dú)特的誘變和轉(zhuǎn)基因機(jī)理，致使其已被廣泛運(yùn)用于農(nóng)作物改良和微生物育種研究中。
　

3、　本論文首先對(duì)多形漢遜酵母 DL-1（ Hansenula polymorpha DL-1， H.polymorpha DL-1）的基因組 DNA提取方法進(jìn)行了優(yōu)化；利用低能N+注入技術(shù)開(kāi)展了低能離子注入介導(dǎo) H.polymorpha DL-1自身基因組 DNA轉(zhuǎn)化 H.polymorpha DL-1細(xì)胞的研究，借助高滲篩選方法獲得丙三醇高產(chǎn)酵母重組菌株，并明確了低能離子注入介導(dǎo)基因組轉(zhuǎn)化 H.polymorpha的最佳注入?yún)?shù)。進(jìn)而，

4、以最佳注入?yún)?shù)開(kāi)展了低能 N+注入介導(dǎo)異源藥用植物紅豆杉基因組 DNA轉(zhuǎn)化酵母的研究，結(jié)合紫杉醇化學(xué)性質(zhì)，構(gòu)建了能生物合成紫杉醇的酵母重組菌株。本研究為低能離子注入介導(dǎo)自身或異源基因組轉(zhuǎn)化酵母提供了理論和實(shí)踐依據(jù)，為開(kāi)發(fā)藥用植物有效成分新藥源途徑、保護(hù)野生藥用植物資源提供了新途徑、新方法，并為保障我國(guó)的甘油供給和保護(hù)我國(guó)紅豆杉植物資源實(shí)現(xiàn)其可持續(xù)續(xù)發(fā)展提供了新思路。
　　具體研究結(jié)果如下：
　?。?）獲得了低能離子注入多形漢

5、遜酵母的存活率曲線圖（即“馬鞍型”曲線），明確了低能 N+注入介導(dǎo)基因組 DNA轉(zhuǎn)化 H.polymorpha DL-1的最佳離子注入?yún)?shù)為：能量：25keV；劑量：25×1015ion/cm2，真空度10-3Pa，脈沖時(shí)間：10s，間隔時(shí)間：10s。
　　（2）獲得了多形漢遜酵母基因組 DNA的高效提取方法。結(jié)果表明 LiOAC/SDS/玻璃珠組合法可以高效運(yùn)用于提取 H.polymorpha DL-1基因組。
　?。?）

6、確定了氯化鈉的高滲篩選甘油高產(chǎn)菌株的方法。以此方法篩選出一株甘油高產(chǎn)酵母工程菌。通過(guò)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后，甘油的產(chǎn)量和底物葡萄糖轉(zhuǎn)化率分別為70.29g/L和53.37％，相對(duì)于出發(fā)菌株提高了27.25%。
　　（4）建立了產(chǎn)紫杉醇酵母重組菌的高通量篩選方法。即 PCR-液相組合篩選方法，具體為首先采用 PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行高通量篩選，進(jìn)而對(duì)候選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行發(fā)酵，再采用 TLC法以及 RP-HPLC法對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行定性定量分析。其中，低能

7、 N+注入介導(dǎo)紅豆杉基因組DNA轉(zhuǎn)化 H.polymorpha DL-1，存活率低，通過(guò) PCR方法進(jìn)行初篩，呈陽(yáng)性的菌株17株，占隨機(jī)挑選菌落的1.7%；再利用 TLC和RP-HPLC方法進(jìn)行復(fù)篩，獲得了一株產(chǎn)紫杉醇的重組菌株，編號(hào)為DL-781，保藏于 CGMCC，編號(hào) No.8999。
　?。?）產(chǎn)紫杉醇酵母重組菌株的發(fā)酵和遺傳穩(wěn)定性：將產(chǎn)紫杉醇酵母重組菌株在 YPD液體培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)72h后，紫杉醇產(chǎn)量為1.106m