FQ-PCR法檢測(cè)重組漢遜酵母HBsAg基因.pdf

1、用于乙型肝炎疫苗生產(chǎn)的重組漢遜酵母工程菌(由華蘭生物公司提供)含有游離質(zhì)粒，可在宿主細(xì)胞中獨(dú)立復(fù)制并表達(dá)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。目前在生產(chǎn)中，為了從基因水平監(jiān)控抗原表達(dá)量，對(duì)發(fā)酵細(xì)胞進(jìn)行了整合基因保有率的檢測(cè)。但該方法只能測(cè)定細(xì)胞中有無(wú)目的基因，不能對(duì)目的基因進(jìn)行定量。由于細(xì)胞內(nèi)整合目的基因拷貝數(shù)的多少直接影響最終的HBsAg的表達(dá)量，所以生產(chǎn)中有必要對(duì)整合的目的基因拷貝數(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。測(cè)定目的基因拷貝數(shù)的方法有很多，如氯化

2、銫-溴化乙錠平衡梯度離心法、高效液相色譜法、核酸雜交方法等等，但他們都有各自的缺點(diǎn)，有的準(zhǔn)確性不高，有的耗時(shí)長(zhǎng)不適于實(shí)時(shí)檢測(cè)。所以建立一種快速準(zhǔn)確的方法對(duì)重組漢遜酵母目的基因拷貝數(shù)的檢測(cè)進(jìn)行檢測(cè)是十分有必要的。本文主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行概述和研究： 1、主要概述了重組乙肝疫苗的分子結(jié)構(gòu)以及研究進(jìn)展。簡(jiǎn)要介紹質(zhì)粒構(gòu)建和工程漢遜酵母菌。對(duì)檢測(cè)重組基因拷貝數(shù)的常用幾種方法進(jìn)行簡(jiǎn)單概述與比較，尤其對(duì)熒光定量PCR法的反應(yīng)原理、方法及應(yīng)用

3、進(jìn)行系統(tǒng)綜述，最后論述了熒光定量PCR法檢測(cè)重組漢遜酵母中HBsAg基因的拷貝數(shù)的應(yīng)用。 2、比對(duì)重組質(zhì)粒表達(dá)載體和漢遜酵母全基因序列，找出重組質(zhì)粒表達(dá)載體上獨(dú)有的序列，設(shè)計(jì)其引物；另外設(shè)計(jì)乙肝表面抗原基因引物。之后提取重組漢遜酵母基因組DNA，分別使用上述兩對(duì)引物進(jìn)行PCR，獨(dú)有序列無(wú)PCR產(chǎn)物則證明無(wú)游離質(zhì)粒載體存在，同時(shí)乙肝表面抗原基因序列有PCR產(chǎn)物則證明有目的基因存在，這兩個(gè)結(jié)果共同支持目的基因的狀態(tài)是整合于酵母染色體

4、上的。 3、重組漢遜酵母基因中外源基因拷貝數(shù)是影響目的基因表達(dá)水平和檢測(cè)傳代穩(wěn)定性的重要因素，因此外源基因拷貝數(shù)的檢測(cè)成為研究和分析重組基因的重要內(nèi)容。利用快速、靈敏的熒光定量PCR法檢測(cè)外源基因(HBsAg)拷貝數(shù)，以Mox基因?yàn)閮?nèi)源參照基因。通過(guò)梯度稀釋法，建立了Mox基因和HBsAg基因的循環(huán)數(shù)(Ct值)與起始模板數(shù)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線，其相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到0.9996和0.9982。通過(guò)目的基因HBsAg和內(nèi)源參照基因Mox在同

5、一熒光強(qiáng)度下出峰的循環(huán)數(shù)比較，獲得了目的基因HBsAg在重組漢遜酵母中的拷貝數(shù)為39個(gè)拷貝。此種方法優(yōu)于傳統(tǒng)的DNA雜交法檢測(cè)重組漢遜酵母HBsAg基因的拷貝數(shù)，比傳統(tǒng)的斑點(diǎn)雜交法快速準(zhǔn)確。 4、通過(guò)對(duì)發(fā)酵前重組漢遜酵母菌種整合的目的HBsAg基因拷貝數(shù)和進(jìn)行生產(chǎn)發(fā)酵后的發(fā)酵液中漢遜酵母菌種整合的目的HBsAg基因拷貝數(shù)測(cè)定，得到了發(fā)酵前目的HBsAg基因在重組漢遜酵母基因組中的拷貝數(shù)為38，發(fā)酵后目的HBsAg基因在重組漢遜酵