新型隱球菌FQ-PCR檢測(cè)體系在血流感染動(dòng)物模型的應(yīng)用研究.pdf

1、目的：建立新型隱球菌血流感染動(dòng)物模型，收集動(dòng)物血漿和肺泡灌洗液標(biāo)本，同時(shí)進(jìn)行FQ-PCR、培養(yǎng)、墨汁染色、組織病理、乳膠凝集實(shí)驗(yàn)對(duì)照觀察，探討FQ-PCR檢測(cè)體系在動(dòng)物模型標(biāo)本中DNA的診斷價(jià)值及與所選的四種比較方法的優(yōu)選性，奠定臨床真菌 PCR檢測(cè)試劑盒開(kāi)發(fā)的基礎(chǔ)，以實(shí)現(xiàn)真菌感染的早期臨床診治，降低臨床真菌感染的病死率及治療成本。
　　方法：
　　1、實(shí)驗(yàn)研究方案：（1）標(biāo)準(zhǔn)株培養(yǎng)及制備，標(biāo)準(zhǔn)新型隱球菌接種于PDA平板37

2、℃培養(yǎng)48小時(shí)后，用接種環(huán)刮取菌落溶于生理鹽水放入已消毒的EP管中；通過(guò)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，制成細(xì)胞濃度約為106CFU/ml的混懸液，作為標(biāo)準(zhǔn)株儲(chǔ)存液，置于-80℃冰箱備用。（2）動(dòng)物模型，32只雄性SD大鼠，采用隨機(jī)分配原則分為4組，同時(shí)稱重，編號(hào)，分別籠養(yǎng)，按時(shí)提供食物和水。A組：免疫抑制感染組（n=10只）:注射環(huán)磷酰胺（150mg/kg）溶液進(jìn)行免疫抑制大鼠，尾靜脈注射新型隱球菌菌懸液感染動(dòng)物；B組:正常狀態(tài)感染組（n=10）,

3、注射等量的生理鹽水，模型建立后尾靜脈注射新型隱球菌菌懸液感染動(dòng)物 C組:正常對(duì)照組（n=6）:正常飼養(yǎng)；D組免疫抑制對(duì)照組（n=6）；僅注射環(huán)磷酰胺（150mg/kg）溶液進(jìn)行免疫抑制大鼠。A+B為實(shí)驗(yàn)組（感染后第3天全部處死），C+D為對(duì)照組（感染后第3天全部處死）。
　　2、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：全文在數(shù)據(jù)處理和分析中均采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，將采集的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組動(dòng)物的血清和支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本FQ-PCR檢測(cè)后結(jié)

4、果進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)組不同天數(shù)與對(duì)照組先進(jìn)行總體的χ2檢驗(yàn)，當(dāng) P<0.05，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)與同一對(duì)照組進(jìn)行兩兩比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)要調(diào)整為a--0.05/2(5.1)，即當(dāng)P<0.00625時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、免疫抑制感染組感染后24小時(shí)出現(xiàn)開(kāi)始出現(xiàn)食欲差，活動(dòng)減少，被毛失去光澤，鼠毛蓬亂，前足抱頭身體呈弓形逐；正常狀態(tài)感染組僅見(jiàn)3例食欲減低，活動(dòng)少，對(duì)照組一般情況良好；<

5、br>　　2、感染后第3天處死大鼠，取肺組織和其它臟器（肝、脾、腦）。實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組大鼠比較，肺組織密布隆起灰白色結(jié)節(jié)，脾稍大，其他臟器未見(jiàn)異常；
　　3、將正常鼠的血漿101CFU/ml混懸液進(jìn)行1:1、1:2、1:3、1:4稀釋，熱帶念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株102CFU/ml混懸液進(jìn)行1:1、1:2、1:3、1:4稀釋，提取DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，重復(fù)8次。新型隱球菌標(biāo)準(zhǔn)株混懸液經(jīng)1:1稀釋后能完全擴(kuò)增，而經(jīng)1:2、1:3、1:4稀釋

6、后樣本未見(jiàn)擴(kuò)增或僅部分?jǐn)U增，該四種反應(yīng)體系能檢測(cè)的靈敏度均可以達(dá)到105CFU/ml；
　　4、將收集的血清及肺組織提取DNA進(jìn)行FQ-PCR檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)組陽(yáng)性率較正常對(duì)照組和免疫對(duì)照組高，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨感染時(shí)問(wèn)延長(zhǎng)，陽(yáng)性率逐漸上升，感染后8小時(shí)之前實(shí)驗(yàn)組FQ-PCR結(jié)果與免疫抑制和正常對(duì)照組差異均無(wú)顯差異；
　　5、在FQ-PCR與血培養(yǎng)、莢膜抗原檢測(cè)、墨汁染色四種對(duì)新型隱球菌檢測(cè)的敏感性比較中，F(xiàn)Q-P

7、CR驗(yàn)敏感性最高，其敏感性為100％,而莢膜抗原達(dá)96.2%，血培養(yǎng)敏感性最低，為58.8%，F(xiàn)Q-PCR技術(shù)在診斷新型隱球菌的敏感性方面明顯高于血培養(yǎng)、墨汁染色、莢膜抗原實(shí)驗(yàn)（χ2＝8.694，P＝0.031）；FQ-PCR技術(shù)在診斷新型隱球菌的特異性方面明顯高于血培養(yǎng)、墨汁染色、莢膜抗原實(shí)驗(yàn)（χ2＝12.129，P＝0.021）；
　　6、101拷貝數(shù)/ul是FQ-PCR的最低檢測(cè)出來(lái)的濃度，上述結(jié)果表明：通過(guò)采用實(shí)時(shí)熒光的方

8、法利用定量PCR的對(duì)FQ-PCR靈敏度進(jìn)行檢測(cè)，其靈敏度為101拷貝數(shù)/ul；
　　7、在六種菌株中，只有新型隱球菌表現(xiàn)出明顯的特異性擴(kuò)增，剩余的五種菌株均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有熒光曲線增長(zhǎng)的現(xiàn)象，上述結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明FQ-PCR檢測(cè)方法對(duì)新型隱球菌的檢測(cè)具有較好的特異性；
　　8、分別將 FQ-PCR檢測(cè)所應(yīng)用的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品中的109拷貝數(shù)/ul、107拷貝數(shù)/ul、105拷貝數(shù)/ul三個(gè)濃度定義為高、中、低，通過(guò)批內(nèi)重復(fù)性檢驗(yàn)，可見(jiàn)上述