豬流行性腹瀉病毒河南株生物學(xué)特性研究及FQ-PCR檢測(cè)方法的建立.pdf

1、豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)是由尼多目(Nidovirales)冠狀病毒科(Coronaviridae family)冠狀病毒屬（Coronaviridae genus）α-冠狀病毒中的豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的豬的一種急性、高度傳染性腸道疾病。自2010年冬季以來(lái)，由PEDV引起的豬流行性腹瀉疫病在全國(guó)大部分養(yǎng)豬省份暴發(fā)和流行，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。有研究表明PED流行毒

2、株是不同與以往經(jīng)典毒株的變異株，但對(duì)于其抗原性、致病性及對(duì)該病的快速鑒別診斷方法等方面還未見(jiàn)相關(guān)全面系統(tǒng)的研究。為了研究河南省PEDV的分子變異情況、細(xì)胞培養(yǎng)特性及特異、快速的鑒別診斷方法，該研究選擇本實(shí)驗(yàn)室已建立的RT-PCR方法檢測(cè)出的具有代表性的PEDV陽(yáng)性樣品，對(duì)其S1基因進(jìn)行序列測(cè)定和遺傳進(jìn)化分析;利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在Vero細(xì)胞、ST細(xì)胞和PK-15細(xì)胞中摸索PEDV培養(yǎng)條件，分別在這3種細(xì)胞中進(jìn)行了PEDV細(xì)胞增殖所需的胰酶

3、濃度、接種時(shí)間及接種劑量的試驗(yàn)，篩選出最適宜PEDV細(xì)胞增殖的條件;大量比對(duì)GenBank中PEDV M基因序列，選取高度保守且具有型特異性基因序列為模板，設(shè)計(jì)1對(duì)PEDV特異性引物和1條TaqMan MGB探針，分別以含有PEDV M基因的pQE30/PEDV重組質(zhì)粒為模板，采用矩陣法篩選最佳引物和探針濃度，優(yōu)化最佳酶濃度和退火溫度，建立了PEDV實(shí)時(shí)熒光定量PCR(fluorescentquantitative real-time

4、PCR，F(xiàn)Q-PCR)檢測(cè)方法，并對(duì)該方法進(jìn)行靈敏性、敏感性、特異性和重復(fù)性試驗(yàn)，同時(shí)與已有的PEDV RT-PCR方法及基因測(cè)序鑒定方法進(jìn)行符合性比較。
　　結(jié)果:16株P(guān)EDV S1基因核苷酸和氨基酸同源性分別為97.9％～99.8％和97.0％～99.6％，與2011年以來(lái)國(guó)內(nèi)登錄的PEDV基因Ⅲ群流行株核苷酸同源性為97.7％～99.5％，氨基酸同源性為97.7％～99.0％;與2011年國(guó)內(nèi)登錄的PEDV基因Ⅰ群流行毒株

5、的核苷酸同源性為89.9％～90.5％，氨基酸同源性為89.7％～91.1％;與2012年國(guó)內(nèi)登錄PEDV流行株核苷酸同源性為98.1％～99.7％，氨基酸同源性為97.3％～99.6％;與2013年國(guó)內(nèi)登錄的PEDV流行株核苷酸同源性為97.2％～99.3％，氨基酸同源性為95.7％～99.6％;與經(jīng)典毒株CV777核苷酸同源性為92.5％～92.9％，氨基酸同源性為90.5％～91.4％。16株S1基因均存在相同的插入和缺失，與20

6、11年以來(lái)國(guó)內(nèi)登錄的基因Ⅲ群流行株相比沒(méi)有大的變異，但與毒株CV777相比較，在第163～166 bp處有3個(gè)核苷酸插入，在173～174 bp之間有9個(gè)核苷酸插入，在405～406 bp之間有3個(gè)核苷酸插入，在463～464 bp之間有3個(gè)核苷酸缺失，這些位點(diǎn)核苷酸的插入和缺失導(dǎo)致了其編碼的氨基酸相應(yīng)改變;系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，河南省16株與2011年以來(lái)國(guó)內(nèi)登錄的大部分流行變異毒株均屬于基因Ⅲ群，而經(jīng)典毒株CV777所在分枝群屬于基因

7、Ⅱ群。
　　PEDV陽(yáng)性樣品能在Vero細(xì)胞中成功增殖至第9代，并能出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變現(xiàn)象。增殖病毒用細(xì)胞培養(yǎng)液中的最適胰酶濃度為5μg/mL，適合接種的最適接種時(shí)間為細(xì)胞生長(zhǎng)至32 h時(shí)，接種的最適劑量為100μL/mL;但PEDV陽(yáng)性樣品在ST和PK-15細(xì)胞中未增殖成功。
　　成功建立了PEDV TaqMan MGB FQ-PCR檢測(cè)方法，其標(biāo)準(zhǔn)曲線的循環(huán)閾值(Ct)與模板濃度具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999，

8、拷貝數(shù)(X)與Ct值之間的線性關(guān)系表達(dá)式為Ct=-3.12×log X+41.67;該方法靈敏度可達(dá)101copies/μL，可特異性的檢測(cè)出PEDV陽(yáng)性樣品，而對(duì)豬瘟病毒(HCV)、豬藍(lán)耳病病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬輪狀病毒(PoRV)以及雞、鴨、牛等其他病毒共93份已知非PEDV樣品及陰性對(duì)照均呈現(xiàn)陰性;不同濃度的PEDV重組質(zhì)粒分別重復(fù)擴(kuò)增3次，重復(fù)結(jié)果良好;與基因測(cè)序鑒定的符合

9、率100％，與RT-PCR方法的符合率為88.7％。
　　本研究結(jié)果表明適合PEDV體外增殖的細(xì)胞為Vero細(xì)胞，且胰酶濃度、接種時(shí)間、接種劑量及細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)都將影響其在細(xì)胞培養(yǎng)中增殖情況;S1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明2011年以來(lái)，我國(guó)流行的PEDV毒株中同時(shí)有基因Ⅲ群和Ⅰ群的存在，但河南流行毒株以基因Ⅲ群為主，其致病性和抗原性差異仍有待進(jìn)一步研究;成功建立的靈敏、快速、特異的FQ-PCR檢測(cè)方法將為PEDV的快速鑒別診斷提供可靠