豬流行性腹瀉病毒的分離鑒定及ELISA檢測(cè)方法的初步建立.pdf

1、豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemicdiarrhea viruse，PEDV)引起的一種急性腸道疾病，以嘔吐、水樣腹瀉為主要特征，嚴(yán)重時(shí)可引起病豬死亡。1978年，該病首次在英國(guó)和比利時(shí)被報(bào)道，此后歐洲、亞洲的多個(gè)國(guó)家相繼報(bào)道了PED的發(fā)生與流行。近幾年，一種變異的PEDV在我國(guó)豬群中開始流行，并引起七日齡以內(nèi)新生仔豬嚴(yán)重腹瀉和高死亡率，本研究從

2、腹瀉仔豬的腸道組織成功分離到一株P(guān)EDV流行毒株，測(cè)定了其全基因組序列，并初步建立了檢測(cè)PEDV抗體的間接ELISA方法和基于單克隆抗體的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA方法。具體研究?jī)?nèi)容如下:
　　1、PEDV的分離鑒定與全基因組分析
　　本試驗(yàn)通過嘗試多種細(xì)胞、培養(yǎng)系統(tǒng)和培養(yǎng)條件，成功分離出一株豬流行性腹瀉病毒。通過間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)、全基因組克隆、同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析等證實(shí)該分離株是目前廣泛流行的變異PEDV，暫時(shí)命名為

3、SH6株，屬于GroupⅡ。全序列分析證明該病毒的基因組大小為28，038 bp，從5'端至3'端，編碼蛋白依次是多聚蛋白(6，781aa)，S蛋白(1，386aa)，ORF3蛋白(224aa)，E蛋白(76 aa)，M蛋白(226aa)和N蛋白(441aa)。
　　2、PEDVN蛋白的原核表達(dá)和間接ELISA檢測(cè)方法的初步建立
　　為建立豬流行性腹瀉病毒N蛋白間接ELISA檢測(cè)方法，本研究從新分離PEDV流行毒株(JS-2

4、013)中擴(kuò)增其N基因，并將N基因克隆至pCold-I DNA原核表達(dá)載體中，構(gòu)建pCold-I-N重組質(zhì)粒，經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)的重組蛋白呈可溶性表達(dá)。將純化的N蛋白作為包被抗原建立PEDV間接ELISA檢測(cè)方法，并且對(duì)各種檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后確定N蛋白最佳包被條件為37℃包被2h，最佳抗原包被量為200 ng/孔，最佳封閉條件為5％脫脂乳37℃封閉2h，最佳血清稀釋度為1∶200，血清最佳孵育時(shí)間為37℃孵育20 min，二抗最適稀

5、釋度為1∶2×104，二抗最佳孵育時(shí)間為40 min，臨界值為0.345～0.394，介于兩者之間為可疑。并對(duì)50份已知背景血清進(jìn)行檢測(cè)，符合率達(dá)94％。該間接ELISA方法為PEDV診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了依據(jù)。
　　3、抗N蛋白單克隆抗體的制備及競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)方法的初步建立
　　將純化的重組N蛋白免疫BALB/c雌性小鼠，運(yùn)用雜交瘤細(xì)胞篩選技術(shù)最終獲得1株穩(wěn)定分泌抗PEDV N蛋白特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，

6、命名為:2B8。擴(kuò)大培養(yǎng)該雜交瘤細(xì)胞株接種BALB/c小鼠，制備腹水。經(jīng)鑒定，腹水效價(jià)在105以上。Western blot和IFA試驗(yàn)結(jié)果顯示該單克隆抗體具有良好的反應(yīng)性和特異性。與其他豬源病毒無交叉反應(yīng)。將獲得的單克隆抗體作為競(jìng)爭(zhēng)一抗初步建立競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法。并對(duì)工作條件進(jìn)行優(yōu)化，確認(rèn)最佳工作條件和陰陽(yáng)性判定臨界值。其中陰性血清臨界值=X+2SD=33.2％，陽(yáng)性血清臨界值=X+3SD=38.6％，介于兩者之間為可疑。