豬流行性腹瀉病毒受體pAPN功能域的初步鑒定.pdf

1、豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)可導(dǎo)致仔豬的嚴(yán)重腹瀉，尤其在東亞各國(guó)傳播非常廣泛，每年都造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。豬流行性腹瀉病毒屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，是Ⅰ群冠狀病毒的成員。目前對(duì)于PEDV感染機(jī)理方面的研究較少，2007年豬氨基肽酶(porcine aminopeptidase N，pAPN)被證實(shí)為PEDV的功能性細(xì)胞感染受體，繼而又有研究從數(shù)量上證實(shí)增加pAPN的密度增大可

2、以PEDV感染率。2010年新的研究通過(guò)嘗試多種不同方式將pAPN添加到Vero細(xì)胞后再感染PEDV，進(jìn)一步可證明pAPN對(duì)PEDV的入侵和增殖的促進(jìn)作用。至今，還未見(jiàn)其它有關(guān)PEDV感染機(jī)理以及pAPN在PEDV感染過(guò)程中作用的研究報(bào)道。
　　 為進(jìn)一步確定pAPN與PEDV結(jié)合的區(qū)域，首先將除去信號(hào)肽的pAPN分為SPA，SPB和SPC三段，接著利用一對(duì)同尾酶XholI和Sal I將信號(hào)肽分別與SPA，SPB和SPC相連接后

3、再構(gòu)建到桿狀病毒表達(dá)載體pFastBac TM1上，通過(guò)桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)體系進(jìn)行表達(dá)。分得到的三段蛋白經(jīng)SDS-PAGE與Western-blot鑒定大小分別為SPA約42 kD，SPB和SPC均約56 kD，與預(yù)期值相符。再利用得到的蛋白免疫小鼠制備相應(yīng)的抗血清，各段抗血清均可與天然pAPN反應(yīng)，證明了所制蛋白具有一定特異性。
　　 為了使pAPN分段蛋白在真核細(xì)胞上進(jìn)行表達(dá)，將與信號(hào)肽相連的SPA，SPB和SPC片段構(gòu)

4、建到哺乳動(dòng)物真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1上，分別將三個(gè)片段轉(zhuǎn)染到PEDV非容許性細(xì)胞MDCK上，應(yīng)用免疫熒光檢驗(yàn)其在MDCK細(xì)胞上的表達(dá)情況，結(jié)果表明SPA，SPB和SPC片段與天然pAPN的多抗血清反應(yīng)均出現(xiàn)了明亮的綠色熒光，證明了三個(gè)片段轉(zhuǎn)染到MDCK后均得到表達(dá)。分別將表達(dá)三個(gè)片段的MDCK細(xì)胞接種PEDV48 h后觀察到細(xì)胞的病變情況，結(jié)果在SPC段的MDCK上接種PEDV48h后出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞脫落，變形等病變。同樣，應(yīng)用

5、免疫熒光技術(shù)也可以在轉(zhuǎn)染SPC片段的MDCK細(xì)胞上檢測(cè)出明亮而清晰的綠色熒光，進(jìn)一步說(shuō)明了表達(dá)的SPC可以與PEDV相結(jié)合。將PEDV在表達(dá)SPC的MDCK上連續(xù)傳代五代后通過(guò)PCR的方法仍可以檢測(cè)到PEDV的存在，這也證明了在MDCK上表達(dá)SPC段蛋白可使PEDV在非容許的細(xì)胞上進(jìn)行增殖。最后在表達(dá)SPC的MDCK上添加相應(yīng)片段抗血清，病變可被抑制發(fā)生。以上結(jié)果均說(shuō)明SPC段在PEDV入侵細(xì)胞及增殖過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，即受體功能域