豬流行性腹瀉病毒的分子流行病學(xué)分析.pdf

1、豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，為冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus)α亞群成員，目前只有一個(gè)血清型。豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由PEDV引起的一種以腹瀉、嘔吐和脫水為主要特征的豬急性腸道傳染病，尤其能引起仔豬死亡，給全世界的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失。

2、>　　2010年冬從華南地區(qū)開(kāi)始，全國(guó)各地豬場(chǎng)先后發(fā)生嚴(yán)重的“仔豬頑固性腹瀉”。為了解豬流行性腹瀉在浙江及周邊地區(qū)的流行情況，本研究采集2011-2013年期間浙江、江西、江蘇、山東、湖北5省27個(gè)豬場(chǎng)的169份病料進(jìn)行檢測(cè)，其中病料PEDV的陽(yáng)性率為56.8％(96/169)，豬場(chǎng)陽(yáng)性率為85.2％(23/27)。對(duì)其中20個(gè)陽(yáng)性病料中PEDV S-ORF3-E-M-N基因、2個(gè)陽(yáng)性病料中PEDV S基因及2個(gè)陽(yáng)性病料中ORF3-E-

3、M-N基因的序列進(jìn)行基因擴(kuò)增和測(cè)序，系統(tǒng)進(jìn)化分析表明:20個(gè)PEDV S-ORF3-E-M-N序列彼此之間的DNA同源性為98.3-100％，與2010年之前的毒株的同源性為94.6-96.5％，與疫苗株的同源性為95.2-95.7％。與2010年之前毒株比較，22個(gè)S基因的同源性為93.4-96.3％，與疫苗株的同源性為93.7-94.3％，并且在S蛋白的55-56aa(GENQ)和135-136aa(N)有2次插入，在155-156

4、aa(DG)有1次缺失。S蛋白抗原區(qū)氨基酸的變化，提示目前該地區(qū)流行株可能源于華南株的疫苗株的重組。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，2010年后的野毒株分為華南地區(qū)毒株與其他地區(qū)毒株兩支;重組分析表明，本研究中的毒株可能為華南毒株與疫苗株的重組結(jié)果。在本研究中也首次發(fā)現(xiàn)JXZS-3L、JXZS-1223L毒株在N基因后12nt處有一個(gè)17nt的插入，ZJJS-Z在N基因后73nt處有一個(gè)TA的缺失，這是首次在PEDV3'UTR發(fā)現(xiàn)的插入和缺失。這些結(jié)

5、果表明，目前流行于浙江及周邊地區(qū)的PEDV毒株與2010年前的毒株比較發(fā)生了新的變異。
　　以原核表達(dá)的PEDV N蛋白為抗原免疫Balb/c小鼠制備抗N蛋白的單克隆抗體。間接免疫熒光和Western blot檢測(cè)顯示，鼠抗N蛋白的單抗能與PEDV疫苗株及真核轉(zhuǎn)染的N蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。利用細(xì)胞融合技術(shù)和有限稀釋方法得到了6株穩(wěn)定分泌抗N蛋白抗體的單克隆抗體細(xì)胞株。亞型鑒定1株單抗的重鏈為IgG2b，其余5株單抗重鏈為IgG1，輕