2012-2013年四川豬流行性腹瀉的分子流行病學(xué)調(diào)查.pdf

1、豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種豬的急性腸道傳染病，其主要特征為嘔吐、腹瀉、脫水和哺乳仔豬高死亡率。近年該病對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的危害特別嚴(yán)重，導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本研究以建立的RT-PCR技術(shù)對(duì)2012-2013年四川部分地區(qū)的流行情況進(jìn)行了調(diào)查，同時(shí)對(duì)S基因進(jìn)行了序列分析，掌握四川PED的流行情

2、況，為四川地區(qū)該病的科學(xué)防控提供依據(jù)。
　　1.RT-PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用
　　參照GenBank參考毒株CV777的M基因序列，應(yīng)用Primers5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)檢測(cè)引物，預(yù)期擴(kuò)增392bp的特異基因片段，建立了RT-PCR檢測(cè)技術(shù)。經(jīng)PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，確立了最佳反應(yīng)體系:MgCl2濃度為1.75 mmol/L，Taq酶濃度為0.05U/μL，dNTP濃度為125μmol/L，引物濃度為0.55 pmol/L。

3、最佳循環(huán)條件為:94℃預(yù)變性3min;94℃變性30s，54℃做退火梯度30s，72℃延伸30s，重復(fù)35個(gè)循環(huán);72℃補(bǔ)充延伸10 min。以豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒等為對(duì)照進(jìn)行特異性試驗(yàn)，同時(shí)經(jīng)臨床檢測(cè)證明該方法效果確實(shí)，有較高的特異性。敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示該方法最低可以檢測(cè)出RNA濃度為138 ng/mL。運(yùn)用建立的RT-PCR方法檢測(cè)了四川9個(gè)地區(qū)送檢的75份仔豬腹瀉病料（小腸及糞便），有66份病料為PEDV陽(yáng)性，腹瀉病料中

4、PEDV陽(yáng)性檢出率為88.00％。結(jié)果分析表明:9個(gè)地區(qū)均檢出PEDV，集中分布在四川中部、東部地區(qū);從發(fā)病年齡看，各年齡的豬都有感染，但死亡多發(fā)生在四周齡以下的哺乳仔豬，發(fā)病季節(jié)除冬春季節(jié)外，近年夏季也呈高發(fā)趨勢(shì);與其他腹瀉病原（豬輪狀病毒、傳染性胃腸炎病毒）相比，四川地區(qū)腹瀉病原中，PEDV感染仍然占主要地位。
　　2.四川地區(qū)PEDV的S基因部分序列的克隆與分析
　　針對(duì)S基因設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增大小為947bp。選取四川地

5、區(qū)檢測(cè)為PEDV陽(yáng)性的9份代表樣品，擴(kuò)增了S基因片段，并進(jìn)行基因測(cè)序，與GenBank上發(fā)表的14條國(guó)內(nèi)外PEDV部分S基因序列比對(duì)分析，并進(jìn)行遺傳進(jìn)化分群。核苷酸及氨基酸同源性分析顯示:核苷酸序列同標(biāo)準(zhǔn)毒株CV777相比，9個(gè)毒株均存在核苷酸的點(diǎn)突變、插入突變和缺失突變;推導(dǎo)的氨基酸序列同毒株CV777相比，9株P(guān)EDV部分S基因均存在氨基酸插入或缺失的現(xiàn)象。核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示:基于S基因的系統(tǒng)樹(shù)將PEDV毒株分為2群G1和G2

6、，其中G1和G2又被分為2個(gè)亞群即G1-1、G1-2和G2-1、G2-2。2012-2013年四川地區(qū)的9個(gè)基因主要集中于G2-2亞群的一個(gè)大分支上，除中國(guó)早期分離株DX（甘肅，2007）獨(dú)在G2-1分支上，其余國(guó)內(nèi)外分離株分布于G1、G2群內(nèi)。近幾年我國(guó)PEDV流行毒株分布于其中3個(gè)亞群內(nèi)，分別是G1-1、G2-1、G2-2。G2-2亞群包括的毒株相對(duì)復(fù)雜，既有我國(guó)以前的地方毒株，也有本次研究的2012年四川地區(qū)流行毒株，以及早期國(guó)外

7、分離毒株CV777、BR1/87。從S基因序列同源性來(lái)看，G2-2亞群內(nèi)的國(guó)內(nèi)外參考毒株與本研究的9株分離毒株的同源性較高，其次是G2-1亞群內(nèi)的參考毒株，G1群內(nèi)的參考毒株與9株分離毒株的同源性最低。與9株分離毒株S基因長(zhǎng)度相比，由于存在堿基缺失或插入現(xiàn)象，導(dǎo)致它們的長(zhǎng)度相差不一。S基因同源性分析結(jié)果表明:四川地區(qū)2012-2013年流行毒株具有多樣性，但大部分流行毒株與我國(guó)以前的流行毒株不同，不但核苷酸序列同源性較低，而且存在大量核