江蘇某豬場2015-2016年豬流行性腹瀉病毒分子流行病學(xué)調(diào)查及基于S蛋白的抗體間接ELISA檢測方法的建立.pdf

1、豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PorcineEpidemic Diarrhea Virus，PEDV)引起的豬的一種高度接觸性腸道傳染病，是目前世界范圍內(nèi)豬場多發(fā)的豬病之一。自2010年10月以來，豬流行性腹瀉病的流行強度和流行區(qū)域在不斷地加強和擴大，尤其對哺乳仔豬致死率較高，可高達(dá)100％。在很多接種過PED疫苗的豬場，本病發(fā)病率及仔豬死亡率仍居高不下，并出現(xiàn)與其他病原

2、混合感染的現(xiàn)象，大大增強了該病的防控難度，也給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。因此，對PED的診斷及其抗體監(jiān)測具有重要意義。雖然目前，已有多種PED的診斷和抗體監(jiān)測技術(shù)，如全病毒包被的ELISA、間接免疫熒光試驗(IFA)等。但全病毒包被ELISA存在大量制備抗原困難、有散毒危險等缺點。IFA則需要昂貴的特殊設(shè)備，不適用于臨床檢測。利用蛋白表達(dá)分子生物學(xué)技術(shù)建立間接ELISA方法成為檢測PEDV抗體新的方向。
　　本研究從江蘇某豬場進

3、行間斷性采樣方法以對豬流行性腹瀉病毒進行分子流行病學(xué)調(diào)查，利用表達(dá)純化的S蛋白建立了檢測其抗體的間接ELISA檢測方法，可進一步了解江蘇某豬場PED的流行特點，評價豬群感染或免疫抗體，為豬群PED疫苗選擇及免疫疫苗后的抗體檢測提供理論指導(dǎo)及檢測手段。
　　1.江蘇某豬場PEDV分子流行病學(xué)調(diào)查
　　為了解江蘇某豬場PEDV的流行情況，應(yīng)用RT-PCR方法對2015年3月至2016年3月間從江蘇某豬場采集的106份疑似豬流行性

4、腹瀉樣品進行PEDV檢測，檢測結(jié)果顯示PEDV陽性率為30.19％(32/106)，豬場內(nèi)各年齡段的豬均有出現(xiàn)PEDV感染的現(xiàn)象。設(shè)計了針對M、N和ORF3基因的特異性引物，對其中2個陽性樣品進行全長擴增，并將擴增的產(chǎn)物進行測序。測序結(jié)果與國內(nèi)外相應(yīng)的基因序列進行比對并構(gòu)建遺傳進化樹，發(fā)現(xiàn)目前分離PEDV參考株主要分為G1、G2兩大支，而該豬場的流行毒株位于G1支上，基于ORF3基因的遺傳進化樹分析可推測，豬場流行毒為PEDV野毒，與國

5、內(nèi)流行毒相近。
　　2.PEDV部分S基因的原核表達(dá)
　　PEDV的S蛋白在免疫介導(dǎo)中起著重要作用，因此本研究對豬場流行毒株的部分S基因（編碼蛋白可產(chǎn)生中和抗體，標(biāo)記為Sp）進行擴增，長度為711 bp，進一步克隆至pET-32a，構(gòu)建了pET-Sp原核表達(dá)質(zhì)粒。重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞后，在28℃、200 rpm條件下，經(jīng)0.2 mM濃度的IPTG誘導(dǎo)獲得可溶性重組S蛋白。Western-blot試驗證明表達(dá)的重

6、組蛋白可與PEDV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，說明該重組蛋白有較好的抗原性。
　　3.PEDV抗體間接ELISA檢測方法的初步建立
　　為監(jiān)測豬場豬群PEDV抗體水平，初步建立了檢測PEDV抗體的間接ELISA方法。純化的S蛋白作為包被抗原，最優(yōu)的包被濃度為0.5μg/ml，4℃包被過夜，10％的小牛血清37℃封閉2h，最優(yōu)的待檢血清稀釋度為1∶200，37℃作用1h，HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG1∶8000稀釋，37℃作用1h，加

7、入TMB顯色液10 min后終止反應(yīng)。當(dāng)待檢血清OD450≥0.273時判為陽性，待檢血清OD450＜0.273時判為陰性。用建立的間接ELISA方法對商品化試劑盒中PRRSV、CSFV、PRV、PCV、FMDV等常見豬病的抗體陽性對照進行檢測均呈陰性，說明該方法具有良好的特異性。分別用不同批次純化的蛋白及同一批次純化蛋白包被的酶標(biāo)板對血清樣品進行檢測，結(jié)果表明該方法具有較好的重復(fù)性。用建立的間接ELISA方法對臨床47份豬血清進行檢測