豬流行性腹瀉病毒S蛋白基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)及間接ELISA抗體檢測(cè)方法的初步建立.pdf

1、豬流行性腹瀉(PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的一種以腹瀉、嘔吐和脫水為主要特征的豬腸遺傳染病。此病多發(fā)于冬季12月至來年2月寒冬季節(jié)，在夏季也可發(fā)生。各種年齡的豬都易感，哺乳仔豬、架子豬或育肥豬的發(fā)病率可達(dá)100％，尤其哺乳仔豬受害最嚴(yán)重，PED的病死率平均為50％。我國(guó)自上世紀(jì)80年代初開始陸續(xù)有PED的發(fā)生，已成為重要的豬病毒性腹瀉病之一。近年來，流行區(qū)域有逐漸擴(kuò)大的趨勢(shì)。因此，建立有效快速的PED檢測(cè)診斷方法非常有必

2、要。但PED與豬傳染性胃腸炎(TGE)及豬輪狀病毒性腹瀉的臨床癥狀、流行病學(xué)、病理變化等無明顯差異，要確診需結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診斷方法，目前PED的診斷方法主要有免疫電鏡法、免疫熒光法、間接血凝試驗(yàn)、RT-PCR法和ELISA法等。相比而言，ELISA法操作相對(duì)簡(jiǎn)單。研究通過基因的克隆和桿狀病毒表達(dá)，以建立ELISA檢測(cè)方法，用于PEDV抗體檢測(cè)。 PEDV的S蛋白在免疫介導(dǎo)中起著重要作用，因此選擇S基因?yàn)槟康幕?，根?jù)GenBank

3、數(shù)據(jù)庫(kù)中的PEDV-S基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，用RT-PCR技術(shù)從國(guó)內(nèi)分離的PEDV安徽株中獲得大小為1206bp(PS1)的PCR產(chǎn)物，將其克隆至pMD18-T載體，提取質(zhì)粒經(jīng)BcoR I和Sa1 I雙酶切鑒定并測(cè)序，序列測(cè)定結(jié)果表明，克隆的PS1蛋白基因完全符合載體閱讀框，擴(kuò)增的PS1基因與PEDV核苷酸序列符合率100％，氨基酸序列符合率100％。將質(zhì)粒與穿梭載體pFastBac1分別進(jìn)行雙酶切，經(jīng)回收后連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，

4、得到重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac1-PS1，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到含桿狀病毒穿梭載體Bacmid的受體菌E.coliDH10Bac，篩選出陽(yáng)性菌落得到重組穿梭載體Bacmid-PS1，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性后，轉(zhuǎn)染到Sf9昆蟲細(xì)胞，5天后收獲病毒。經(jīng)RT-PCR、IFA、SDS-PAGE和Western-blotting鑒定PS1基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，結(jié)果表明，重組桿狀病毒PS1蛋白(約47KD)在Sf9昆蟲細(xì)胞中得到表達(dá).以重組桿狀