豬偽狂犬病病毒gE基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)及阻斷gE-ELISA方法的建立.pdf

1、豬偽狂犬病是一種主要引起公豬不育、母豬流產(chǎn)死胎、新生仔豬大量死亡、育肥豬生長停滯的一種危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病之一。近些年來，偽狂犬病在我國呈爆發(fā)流行趨勢，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失。
　　gE基因是偽狂犬病毒11個囊膜糖蛋白中一個十分重要的毒力蛋白基因。當(dāng)前市場上PRV大部分的弱毒疫苗和滅活疫苗均有缺失gE基因，但因?yàn)閭慰袢哂袧摲腥拘?，單純使用疫苗并不能根除PRV。因此，結(jié)合相應(yīng)的區(qū)分野毒感染豬和疫苗免疫豬的鑒別診斷方法，堅(jiān)

2、決淘汰PRV野毒感染豬是根除偽狂犬的根本措施。目前，我國的PRV野毒鑒別診斷主要依賴于進(jìn)口國外昂貴的試劑盒，開發(fā)出能準(zhǔn)確鑒別PRV野毒的國產(chǎn)診斷試劑盒十分必要。
　　本研究通過將PRV gE基因克隆至pFastBac/HBM-TOPO載體，轉(zhuǎn)化含有桿狀病毒穿梭質(zhì)粒的DH10BacTM E.coli，通過三重抗性和藍(lán)白斑篩選，得到含有PRV gE基因的重組Bacmid，將其轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒。分別用間接免疫熒光（I

3、FA）、SDS-PAGE和Western blot方法，對重組桿狀病毒表達(dá)的蛋白進(jìn)行鑒定和分析，結(jié)果表明：gE蛋白在Sf9細(xì)胞中得到高效表達(dá)，并且具有良好反應(yīng)原性。
　　使用經(jīng)過蔗糖梯度密度離心純化的PRV病毒免疫6-8周齡BALB/c小鼠，4次免疫后取小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，以表達(dá)gE蛋白作為抗原建立的間接ELISA方法篩選陽性細(xì)胞克隆，經(jīng)過三次亞克隆獲得了3株穩(wěn)定分泌gE單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1H1、7D4、5F

4、2。通過相對親和力測定和IFA效價(jià)檢測，結(jié)果1H1單抗和gE蛋白的相對親和力最強(qiáng)，IFA的效價(jià)最高，達(dá)1:1600。對1H1單抗的生物學(xué)特性鑒定表明：其染色體數(shù)目正常，抗體亞類其重鏈為IgG1,輕鏈為κ。IFA特異性鑒定表明其具有良好的特異性。
　　采用改良過碘酸鈉法將1H1gE單抗進(jìn)行HRP酶標(biāo)記，以gE蛋白作為包被抗原，建立了PRV gE阻斷ELISA方法。對常見的豬病毒病CSFV、PPV、PRRSV、JEV的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行