豬偽狂犬病病毒的分離及其gE--TK-雙基因缺失株的構(gòu)建.pdf

1、偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)屬于皰疹病毒甲亞科水痘皰疹病毒屬，分類學(xué)命名為豬皰疹病毒Ⅰ型。PRV能引起仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、死亡，母豬流產(chǎn)、弱胎、死胎，育肥豬食欲下降、增重緩慢等現(xiàn)象，給世界各國養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。豬偽狂犬病的防控主要依賴于疫苗的使用，尤其是基因缺失疫苗的應(yīng)用。我國自1948年首次發(fā)現(xiàn)PRV以來，通過廣泛使用PRV疫苗有效控制了疫情。但是近幾年，部分免疫過的豬場卻出現(xiàn)疑似豬偽狂犬病的癥狀。<

2、br>　　本研究收集浙江一免疫豬場的疑似患病仔豬腦組織病料，將病料經(jīng)無菌研磨處理后接種Vero細(xì)胞進(jìn)行病毒分離。結(jié)果顯示，病料接種Vero細(xì)胞后36 h出現(xiàn)細(xì)胞圓縮、折光性增強(qiáng)、細(xì)胞脫落等現(xiàn)象。分離物經(jīng)PCR鑒定、蝕斑純化以及電鏡觀察確定為偽狂犬病毒，命名為DX株。遺傳進(jìn)化分析顯示，DX株gE序列與近期國內(nèi)一些免疫豬中分離到的野毒株序列相近，而與一些歐洲分離株距離較遠(yuǎn)。相應(yīng)的gE基因序列推導(dǎo)的氨基酸序列分析結(jié)果表示，DX株與早前分離到的

3、毒株比較明顯的區(qū)別即在48位有天冬氨酸(D)的插入，54位(G＞D)、448位(V＞I)、492位(G＞D)、551位(G＞S)均有突變。相應(yīng)的gB和gC基因氨基酸分析結(jié)果顯示，新流行毒株與先前分離株相比分別有3個(gè)氨基酸缺失和7個(gè)氨基酸的插入。小鼠致病性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DX株LD50(104.00TCID50)要略弱于經(jīng)典強(qiáng)毒株SC株的LD50(103.32TCID50)，家兔感染后也呈現(xiàn)典型的PRV感染癥狀。
　　通過高通量測序平

4、臺(tái)Hisq2000和PCR補(bǔ)足，我們獲得了DX株141660bp的基因組序列，其基因組GC含量73.6％(C37％，G36.6％)。與經(jīng)典的Kalplan株、Becker株、Bartha株相似，DX株基因組含69個(gè)開放閱讀框，但編碼的許多重要糖蛋白發(fā)生了氨基酸變異、插入、缺失現(xiàn)象。如，與宿主免疫相關(guān)的gC在63-69位有7個(gè)aa插入，類似功能的gD糖蛋白在280-281位缺失RP;比較保守的gB糖蛋白與Bartha株相比在75-77位連

5、續(xù)缺失3個(gè)氨基酸，313位變異(V＞M);與胞間傳播相關(guān)的gN在49位變異(A＞T)。主要毒力基因TK無明顯重大變異。與病毒在宿主體內(nèi)的早期有效轉(zhuǎn)錄密不可分的基因IE180，出現(xiàn)了99位(P＞Q)、100位(R＞Q）、176位(S＞P)、460位(A＞S)的變異;被膜蛋白中變異較大的是UL13，出現(xiàn)了28-34位7個(gè)aa的連續(xù)缺失;外膜蛋白中的UL20則在7、19、20、21位出現(xiàn)了氨基酸的插入。進(jìn)化樹分析顯示，DX株與中國最近的流行株

6、均處于一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的分支。
　　我們利用Cre/loxp系統(tǒng)構(gòu)建了兩個(gè)用于敲除gE和TK基因的轉(zhuǎn)移載體:PUC18-gEloxpCherry、PUC18-TKloxpEGFP。通過親本株基因組DNA與PUC18-gEloxpCherry質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染、蝕斑純化，我們得到一株缺失了gE主要抗原區(qū)域883 bp的gE-單基因缺失株，并通過相同的方法獲得了一株缺失TK主要保守基因330 bp的TK-單基因缺失株。在PRV DX gE-的基

7、礎(chǔ)上，將其基因組DNA與PUC18-TKloxpEGFP共轉(zhuǎn)染，再經(jīng)Cre重組酶處理以及蝕斑純化最終獲得了gE-/TK-雙基因缺失株。對(duì)gE-單基因缺失株、TK-單基因缺失株以及gE-/TK-雙基因缺失株、親本株P(guān)RV DX的滴度進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞適應(yīng)毒在Vero細(xì)胞上的滴度分別為10-7.25TCID50/0.1 ml、10-7.15TCID50/0.1 ml、10-7.28TCID50/0.1 ml、10-7.35TCID50/0