豬偽狂犬病病毒FZJX株的分離鑒定及TK基因的克隆與序列分析.pdf

1、本試驗從福州郊區(qū)某豬場病死豬的肺臟中分離到一株病毒，運用相關的試驗方法對該分離病毒進行鑒定，結果證實該分離病毒為偽狂犬病病毒，并對該株病毒的TK(胸苷激酶)基因進行克隆和序列分析。 該株病毒初次接種Marc-145細胞未見明顯的細胞病變，經(jīng)過一代盲傳，從第二代開始產(chǎn)生了細胞圓縮、聚集、溶解和脫落等典型的細胞病變，并可見到大量的多核巨細胞，產(chǎn)生細胞病變的時間為48h左右；經(jīng)過連續(xù)傳代后，產(chǎn)生細胞病變的時間明顯縮短，基本穩(wěn)定在20h

2、左右。在電鏡下能觀察到直徑約為150-180nm、有囊膜、呈圓形或橢圓形的病毒粒子，囊膜表面有呈放射狀排列的纖突；細胞核內可見到包涵體；病毒粒子在胞質囊泡和細胞膜上出芽生殖。該病毒對雞紅細胞和大鼠紅細胞沒有血凝活性，而對小白鼠紅細胞具有血凝活性，其血凝效價為1：64。對雞胚做絨毛尿囊膜接種時，死亡的雞胚在絨毛尿囊膜上出現(xiàn)白色痘斑樣病變，尿囊膜水腫、充血，胚體頭蓋部突起，全身彌漫性出血；而對雞胚做尿囊腔接種時，胚體出現(xiàn)類似的病變，但在絨毛

3、尿囊膜上沒有出現(xiàn)痘斑樣病變。病毒液接種家兔和小白鼠，分別經(jīng)過59h、96h死亡，兩者都出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，但沒有出現(xiàn)奇癢和啃咬的癥狀。病毒液接種斷奶仔豬，仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，同時體溫升高達41℃；接毒10天后體溫和食欲恢復正常，神經(jīng)癥狀消失，仔豬表現(xiàn)為耐過。用分離病毒感染細胞，提取病毒和細胞的總DNA，在PRV的TK基因上設計一對特異性引物，通過PCR技術成功擴增出約917bp的特異片段，與預期結果一致，進而從核酸水平證實了所分離的病毒為PRV

4、。以上試驗結果表明從該豬場分離到的病毒是豬偽狂犬病病毒，并命名為FZJX株。 通過對TK基因進行克隆和序列分析，我們發(fā)現(xiàn)PCR擴增的917bp基因片段中含有一個長為897bp的開放閱讀框，共編碼298個氨基酸。利用DNAStar軟件將該序列與GenBank中收錄的Ea株(序列號為AF080571)、SH株(序列號為AF199413)、Min-A株(序列號為171242)、LA株(序列號為AY173125s1)、Korea株(序列

5、號為217095)、USA株(序列號為E00505)、Spain株(序列號為X55001)、FJFZ株(序列號為FJ477295)的TK基因進行序列比對，并推導出其編碼的氨基酸序列，分別對其進行同源性比較和進化樹分析。同源性比較結果顯示，F(xiàn)ZJX株TK基因與USA株、Ea株、FJFZ株、Korea株、LA株、Min-A株、SH株、Spain株TK基因的同源性分別為：93.3％、99.7％、99.3％、99.4％、99.8％、98.3％、