豬偽狂犬病毒冀A株gD基因的克隆、表達(dá)及檢測.pdf

1、本研究利用三種不同的方法提取豬偽狂犬病毒冀A株的核酸，并根據(jù)文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)了一對特異性引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出了PRV冀A株的gD基因。經(jīng)瓊脂糖電泳檢測，純化目的片段與pUC18克隆載體連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，得到轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR鑒定和酶切分析篩選出陽性克隆。結(jié)果表明，作者得到的陽性重組子(pUC1.2)中含有g(shù)D基因，表明是正確插入，并把陽性克隆質(zhì)粒送大連寶生物公司測序。經(jīng)核苷酸測序，該基因全長1197

2、bp，含有一個(gè)開放閱讀框，編碼398個(gè)氨基酸，與國內(nèi)外5株不同來源的毒株進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)冀A株gD基因存在13處點(diǎn)突變和一處缺失突變，并發(fā)現(xiàn)PRVgD在816nt-831nt處有一處C(A)GGCCC重復(fù)高變區(qū)，對應(yīng)于gD268位-275位Arg-Pro重復(fù)高變區(qū)。使用DNAstar軟件將冀A株gD基因核苷酸序列與上述毒株-YangSan、Ea、Fa、Ka、閩A(Min-A)株的gD基因序列進(jìn)行比較，其同源性在98.8﹪～99.7﹪之間

3、。將冀A株gD基因推導(dǎo)的氨基酸序列與上述5個(gè)毒株P(guān)RVgD基因氨基酸序列進(jìn)行比較，同源性在77.9﹪～79.2﹪之間?？梢姴煌瑏碓吹腜RV毒株gD基因在核苷酸水平上的同源性較高，但在氨基酸水平的同源性則具有一定差異。并繪制了系統(tǒng)發(fā)育樹，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹分析，冀A株與閩A(Min-A)株表現(xiàn)出了明顯的親緣關(guān)系。 作者將正確的重組克隆質(zhì)粒pUC1.2用EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切，電泳回收目的片段，將目的片段插入經(jīng)EcoRⅠ、BamH

4、Ⅰ雙酶切處理的pGEX-4T-3中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中，得到的轉(zhuǎn)化子經(jīng)酶切分析，篩選出符合閱讀框的重組子，構(gòu)建出重組表達(dá)質(zhì)粒pGgD，并在大腸桿菌BL21(DE3)宿主菌中成功地表達(dá)了含目的蛋白的融合蛋白，融合蛋白的分子量約為53KD，加入IPTG(1mmol/L)誘導(dǎo)6h后，蛋白表達(dá)達(dá)到最高水平。經(jīng)Western-blotting雜交實(shí)驗(yàn)，目的蛋白與兔抗PRV冀A株抗體反應(yīng)，表明表達(dá)產(chǎn)物為PRV冀A株gD蛋白，且具有一