偽狂犬病毒重組豬細(xì)小病毒VP2基因活載體疫苗株的研究.pdf

1、本研究從四川某豬場流產(chǎn)死胎及木乃伊胎中分離了一株豬細(xì)小病毒，命名為PPV-SC1株。該株病毒能在豬腎原代細(xì)胞、PK-15細(xì)胞、ST細(xì)胞和IBRS-2細(xì)胞上增殖并引起細(xì)胞病變，細(xì)胞出現(xiàn)聚集、融合現(xiàn)象；分離毒能凝集2％的豚鼠紅細(xì)胞，血凝效價可達(dá)2-10，血凝抑制效價可達(dá)2-9；熒光抗體染色在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均可見特異性熒光，呈蘋果綠色　　以CMV早期啟動子控制的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因作為報告基因，將其插入pPI-2中g(shù)I基因起

2、始密碼子ATG下游的StuI位點，構(gòu)建了以gI為同源序列含有EGFP報告基因的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pPI-2.EGFP?！　〔捎昧姿徕}轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，將PRV基因缺失疫苗SA215株DNA與PRV基因缺失表達(dá)載體質(zhì)粒pPI-2.EGFP.VP2DNA共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后通過直接熒光觀察、Dot-blots核酸雜交篩選得到幾株重組病毒，將其中一株(命名為SA215(B))病毒DNA用BamHⅠ酶切和Southern轉(zhuǎn)印雜交進(jìn)一步驗證重組病毒成功構(gòu)建。

3、并通過SDS-PAGE電泳和Western免疫印跡檢測表明PPVVP2基因在重組病毒內(nèi)獲得表達(dá)，產(chǎn)生大小約93kDa的融合蛋白，同時融合蛋白中的PPVVP2結(jié)構(gòu)蛋白仍然保持了原有的抗原性，表明成功構(gòu)建了含綠色熒光蛋白基因的豬細(xì)小病毒病-偽狂犬病重組病毒。培養(yǎng)增殖特性試驗表明重組病毒SA215(B)株可適應(yīng)Vero細(xì)胞、BHK21細(xì)胞、IBRS-2細(xì)胞、PK-15細(xì)胞、ST細(xì)胞、MDBK細(xì)胞、Marc145細(xì)胞和雞胚成纖維細(xì)胞，但對不同細(xì)