豬偽狂犬病毒、豬細(xì)小病毒和豬圓環(huán)病毒2型聯(lián)合共檢可視化基因芯片檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、隨著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)向集約化和規(guī)?；较虬l(fā)展，規(guī)模化豬場(chǎng)疫病多發(fā)、多種病原混合感染較普遍存在，給養(yǎng)豬業(yè)造成了一定損失。其中豬偽狂犬病毒(PRV)、豬細(xì)小病毒(PPV)和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)是引起豬繁殖障礙的三種重要疫病病原。這三種病臨診癥狀相似，需要進(jìn)行鑒別診斷。本研究旨在進(jìn)行PRV-PPV-PCV2聯(lián)合共檢可視化基因芯片的構(gòu)建，并建立其檢測(cè)方法和進(jìn)行初步應(yīng)用評(píng)價(jià)研究，該研究成功制備PRV-PPV-PCV2聯(lián)合共檢可視化基因芯片和建立其

2、檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果不需掃描儀肉眼即可見(jiàn)。主要研究如下:
　　1.探針基因重組質(zhì)粒菌的構(gòu)建
　　本試驗(yàn)成功構(gòu)建了用于制備可視化基因芯片的T/NS1和T/ORF2兩個(gè)檢測(cè)探針以及T/PUC18和T/GAPDH兩個(gè)定位探針基因重組質(zhì)粒菌。
　　根據(jù)Genbank中收錄的基因序列，設(shè)計(jì)PPV、PCV2、PUC18和GAPDH各1對(duì)特異性引物。以PPV滅活疫苗、PCV2實(shí)驗(yàn)室分離株為材料提取其基因組DNA。以各基因組D

3、NA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增克隆獲得PPV NS1、PCV20RF2、PUC18和GAPDH基因，其長(zhǎng)度大小分別為100 bp、122 bp、217 bp、257 bp.將所獲得的4個(gè)基因分別與pMD19-T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)PCR擴(kuò)增和核酸序列測(cè)定成功地篩選出4個(gè)探針基因重組質(zhì)粒菌。為可視化基因芯片的構(gòu)建建立了可長(zhǎng)期保存的探針基因，是芯片制備的核心技術(shù)之一。
　　2.可視化基因芯片的構(gòu)建與檢測(cè)技術(shù)優(yōu)化
　　本試

4、驗(yàn)對(duì)可視化基因芯片的制備及其檢測(cè)操作程序的優(yōu)化進(jìn)行了研究，并確定了芯片檢測(cè)質(zhì)量與結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。制備的芯片可對(duì)PRV、PPV、PCV2進(jìn)行檢測(cè)，并可對(duì)PRV的疫苗株與野毒株感染進(jìn)行區(qū)分。
　　基因芯片的制備以探針基因重組質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增、乙醇沉淀法純化制備探針基因。使用Baio(R)點(diǎn)樣緩沖液將其稀釋至一定濃度，經(jīng)變性處理后噴樣。噴樣完成固定一定時(shí)間即成功制備好芯片。
　　靶基因的標(biāo)記以提取的病毒基因組DNA為模板，經(jīng)

5、PCR擴(kuò)增對(duì)靶基因進(jìn)行生物素標(biāo)記。在PCR的擴(kuò)增標(biāo)記體系中，加入5'端標(biāo)記有生物素的上游引物，隨著PCR的擴(kuò)增對(duì)靶基因進(jìn)行標(biāo)記。
　　芯片制備與檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)化對(duì)探針基因噴樣濃度、重復(fù)噴樣次數(shù)、探針基因固定時(shí)間、雜交時(shí)間及底物顯色時(shí)間進(jìn)了優(yōu)化，確定了芯片檢測(cè)的操作程序?yàn)?探針基因噴樣濃度為100 ng/ul，用點(diǎn)樣儀一次噴樣，放置80℃固定2h即成功制備好芯片。芯片44℃預(yù)雜交1.5 h;將靶基因95℃變性10 min后立即冰浴冷卻

6、5 min，各取100ul進(jìn)行芯片雜交1.5 h.然后用洗液Ⅰ，洗液Ⅱ，洗液Ⅲ依次各洗滌5 min;37℃封閉40 min;37℃酶聯(lián)30 min后按上述條件再次洗滌，加入底物顯色8 min后即完成雜交。
　　芯片檢測(cè)質(zhì)量與結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)確定了芯片檢測(cè)質(zhì)量與結(jié)果判定的標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)陽(yáng)性對(duì)照生成棕色斑點(diǎn)，空白對(duì)照無(wú)斑點(diǎn)生成，以及陰性對(duì)照無(wú)斑點(diǎn)生成或斑點(diǎn)顏色較淡來(lái)判定芯片的質(zhì)量;根據(jù)靶基因與陰性對(duì)照和空白對(duì)照的斑點(diǎn)顏色對(duì)比的深淺來(lái)判定檢測(cè)結(jié)

7、果是否為陽(yáng)性。
　　3.可視化基因芯片檢測(cè)技術(shù)的評(píng)價(jià)
　　本試驗(yàn)對(duì)決定芯片質(zhì)量的特異性、靈敏性和保存期進(jìn)行了研究，并將其應(yīng)用于臨床樣本的檢測(cè)，同時(shí)比較其與PCR檢測(cè)結(jié)果的吻合度。
　　特異性、靈敏性和保存期檢測(cè)對(duì)所構(gòu)建芯片的特異性、靈敏性和保存期進(jìn)行了研究。分別用PRV、PPV、PCV2、CSFV、PRRSV、JEV PCR標(biāo)記產(chǎn)物與芯片進(jìn)行雜交，以檢測(cè)其特異性;將各探針基因質(zhì)粒DNA，PCR擴(kuò)增標(biāo)記，分別作10×系列

8、倍比稀釋后與芯片進(jìn)行雜交，以檢測(cè)其靈敏性;以PCV2檢測(cè)基因芯片為例，分別將保存30天、60天、90天和120天后的芯片各抽取一張，進(jìn)行雜交檢測(cè)，以檢測(cè)其保存期。結(jié)果表明，CSFV、PRRSV、JEV檢測(cè)結(jié)果均為陰性，PRV、PPV、PCV2各靶基因之間也無(wú)交叉反應(yīng)，表明其特異性好;PRV-gB、PRV-gE、PPV-NS1和PCV2-ORF2探針基因的靈敏性分別為:18.3 pg/ul、17.4 pg/ul、11.7 pg/ul和13

9、.2 pg/ul，均較PCR靈敏性高10倍;芯片在保存120天后仍可進(jìn)行有效檢測(cè)。
　　臨床樣本檢測(cè)應(yīng)用所構(gòu)建的芯片對(duì)四川、重慶、福建、貴州、甘肅等地103份臨床樣本進(jìn)行了檢測(cè)。提取病死豬的組織基因組DNA，用PCR擴(kuò)增標(biāo)記后進(jìn)行雜交檢測(cè)，比較其與PCR檢測(cè)結(jié)果的吻合度。結(jié)果表明:PRV、PPV、PCV2的陽(yáng)性率分別為22.3％（其中疫苗株為2.9％，野毒株為19.4％）、8.7％、78.6％， PRV+PPV為8.7％，PRV+